Modelado de la metástasis del cáncer de ovario en el revestimiento de la cavidad peritoneal: un método para establecer un modelo 3D in vitro del revestimiento peritoneal

Resumen

Fuente: Peters, P. N. et al. Modelando los primeros pasos de la diseminación del cáncer de ovario en un cultivo organotípico de la cavidad peritoneal humana. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos el desarrollo de un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal. Este cultivo organotípico puede ayudar a investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Protocolo

>1. Enchapado del cultivo organotípico

1. Libere NOF (fibroblastos omentales normales) de un matraz de cultivo de 75^cm2 enjuagando con 10 ml de PBS seguido de 3 ml de tripsina al 0,25%/EDTA 25 mM durante no más de 5 min. Neutralice la tripsina con al menos 3 veces el volumen del medio de crecimiento completo.
2. Transfiera las células tripsinizadas a un tubo cónico de 50 ml y centrifuga a 0,5 g x 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a subir las células en 5 ml de medio de crecimiento completo. Utilice un contador de células para contar las células recuperadas del matraz de cultivo.
3. Diluya las células en el volumen apropiado de medio de crecimiento completo para colocar una placa de 2,000-4,000 NOF por 100 μl en una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos. Añada 0,5 μg/100 μl de colágeno I de cola de rata a la mezcla celular antes de la siembra. Deje reposar las células a 37 °C con 5% de CO₂ en un ambiente humidificado durante al menos 4 h, o hasta que las células se adhieran a la superficie de la placa.
4. Libere HPMC (células mesoteliales humanas primarias) del matraz de cultivo utilizando los mismos métodos descritos en los pasos 1.1 y 1.2. Diluya las células en la cantidad adecuada de medio de crecimiento completo para colocar una placa de 10.000-20.000 HPMC por 50 μl encima del NOF ya sembrado con colágeno I en placas de 96 pocillos. Deje que las células se asienten a 37 °C con 5% de CO₂ en un ambiente humidificado durante al menos 18 horas antes de comenzar los experimentos.
5. Cultivo de células de cáncer de ovario HeyA8 que expresan proteína fluorescente verde (GFP) en medios de crecimiento completos. Las células de cáncer de ovario HeyA8 se marcan con fluorescencia mediante la expresión de un vector lentiviral que expresa cGFP de copépodo (pCDH-CMV-MCS-EF1). Las células de cáncer de ovario HeyA8 deben tener un 80-90% de confluentes el día de su uso (fase de crecimiento logarítmico). Libere las células de la placa de cultivo y cuente utilizando los mismos métodos descritos en los pasos 1.1-1.2 para las células primarias.
6. Deje que las células de cáncer de ovario se recuperen en un medio de crecimiento completo durante 15-20 minutos a 37 °C en un tubo cónico con la tapa sin apretar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pbs	Fisher Científico	SH3001304
Platos de cultivo de 15 cm	BD Biociencias	353025
DMEM con L-Glutamina	Corning	10-013-CV
Vitaminas MEM	Corning	25-020-CL
MEM Aminoácidos no esenciales	Corning	25-025-CI
Penicilina-Estreptomicina	Corning	30-002-CI
sacudidor	Termo-Fisher	MaxQ 4450
centrífuga	Eppendorf	5702
incubadora	Termo-Fisher	Forma Serie II Camisa de Agua Incubadora de CO2 modelo 3100
Tripsina EDTA, 1x (0,25%)	Corning	25-053-CI
Frascos T-75	BD Biociencias	353136
Frascos T-175	BD Biociencias	353112
Puntas de pipeta	Lluvia	P2, P10, P20, P200 y P1000
Puntas de pipeta	Corning	Puntas filtradas P2, P10, P20, P200 y P1000
Contador de células	Invitrogen	condesa
Cámara de recuento de células Countess Diapositivas	Invitrogen	C10313
Mancha azul de tripán (0.4%)	Gibco	15250-061
Colágeno Tipo I (Cola de Rata)	BD Biociencias	354236
Placa de 96 pocillos, fondo transparente, negro	BD Biociencias	353219