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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento y cultivo de células estromales primarias no transformadas
- Recolección y preparación de tejido humano.
- Obtener muestras de epiplón humano, de 2 cm3, extraídas durante una cirugía abdominal, e inmediatamente sumergir el tejido en solución salina tamponada con fosfato RT (PBS) (Figura 1A). Un pedazo de epiplón de 3 cm x 2 cm generalmente produce 1 millón de células mesoteliales humanas primarias (HPMC) y 200,000 fibroblastos humanos primarios o fibroblastos omentales normales (NOF).
- Gire el PBS en el que se sumergió el tejido a 0,5 x g durante 3 minutos tan pronto como sea posible después de la recolección (< 2 horas en PBS) y transfiera el tejido a 20 ml de PBS fresco en un tubo cónico de 50 ml. Cortar el tejido en trozos de 5 mm3 picando con bisturíes en una placa de cultivo estéril de 15 cm de diámetro (Figura 1B).
- Aislamiento primario de células mesoteliales humanas
- Para aislar la HPMC, transfiera el tejido picado a tubos cónicos de 50 ml y espere 1 minuto para que las piezas sólidas floten hacia la parte superior (Figura 1C y D). La HPMC y los glóbulos rojos estarán presentes en el líquido del fondo. Use una pipeta para extraer el líquido del fondo del tubo y colocarlo en un nuevo tubo cónico. Centrifugar el líquido a 0,5 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante del pellet HPMC/RBC.
- Repita el proceso tres veces: agregue 20 ml de PBS al tejido picado, deje que el tejido suba, elimine el líquido del fondo con una pipeta y dentro del tubo HPMC/RBC, gire hacia abajo y retire el sobrenadante. Una vez que se completan todos los giros y se aspira el sobrenadante, el pellet contendrá HPMC y RBC.
- Coloque todas las células del pellet en un matraz de 75cm2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% de suero fetal bovino [FBS],1% de vitaminas MEM [93 mg/L], 1% de aminoácidos no esenciales MEM [81,4 mg/L], 1% de penicilina, estreptomicina [Pen-Strep, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina]).
- Realice un lavado secundario de PBS para aislar HPMC adicionales.
- Para el lavado secundario de PBS, agite el tejido sólido restante a 200 rpm, 37 °C durante 10 min en 20 ml de PBS, luego espere 1 min para que el tejido flote hacia la superficie. Retire el líquido del fondo del tubo y colóquelo en un tubo nuevo, centrifugue a 0,5 x g durante 3 minutos y aspire el sobrenadante.
- Coloque todo el HPMC/RBC del lavado secundario de PBS en un matraz separado de 75cm2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
- Para aislar cualquier resto de HPMC, agite el tejido picado a 200 rpm, 37 °C grados durante 10 min en 20 ml de una solución 1:1 de tripsina al 0,25% 25 mM EDTA:PBS por volumen. Deje que el pañuelo suba, recoja el líquido en el fondo del tubo en un nuevo tubo de 50 ml y gire a 0,5 x g durante 3 minutos.
- Aspire el sobrenadante y coloque todo el HPMC/RBC en un matraz separado de 75cm2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
- Cultive las células plateadas a 37 °C y 5 % de CO2 en un entorno humidificado. Alimente las células plateadas añadiendo 15 ml de medio de crecimiento completo en los días 3 y 5 sin retirar el medio gastado. La HPMC se puede cultivar durante 5-7 días antes de dividirse.
- Utilice HPMC de paso bajo (hasta el paso 2) en todos los experimentos para minimizar la desdiferenciación y modificación del fenotipo original. Utilice un microscopio de campo amplio, preferiblemente con un objetivo de 20x con capacidad de contraste de interferencia diferencial de plástico o un objetivo de 4-20x con capacidad de contraste de fase (filtros de contraste de fase en el microscopio) para tomar todas las imágenes de las células, y un objetivo de 10x ()en campo claro para analizar la tinción inmunohistoquímica de 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
- Confirmar que las HPMC son cuboidales y expresan citoqueratina 8 y vimentina mediante la realización de inmunohistoquímica (Figura 2A, C, E).
