Modelado de la colonización de células de cáncer de ovario por epiplón: un método ex vivo para establecer la colonización por manchas lechosas de células de cáncer de ovario marcadas con fluorescencia en explantes de epiplón murino

Resumen

Fuente: Krishnan, V. et al. Enfoques in vivo y ex vivo para estudiar el cáncer de ovario Colonización metastásica de las estructuras de la mancha lechosa en el tejido adiposo peritoneal. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, establecemos un cultivo de órganos omental ex vivo superpuesto con células de cáncer de ovario que expresan GFP para estudiar la colonización del cáncer de ovario dentro del explante de epiplón. Este protocolo analiza las estructuras de las células inmunitarias dentro del epiplón conocidas como manchas lechosas que promueven las metástasis.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Colonización de la mancha lechosa ex vivo

1. Establecimiento de condiciones básicas de cultivo de órganos ex vivo
   1. Coloque cada epiplón en un solo inserto de placa de cultivo y colóquelo dentro de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos que contenga 500 μl de medios DME/F12 que contenga 20% de FCS. Mantener los cultivos de órganos a 37 °C en un entorno con 5% de CO₂ durante 24 a 48 horas y/o puntos de tiempo adicionales. Utilice tres omenta independientes (muestras triplicadas) para cada condición (p. ej., tipo de medio/punto de tiempo).
   2. Para confirmar la integridad de los tejidos en los puntos finales experimentales, fije y procese las muestras como se describe en el paso 1.1.3. El recuento de adipocitos sanos frente a los necróticos en las secciones de H&E puede evaluar la integridad del tejido. Se requiere un mínimo de ~ 120 células de cinco muestras biológicas para formular un porcentaje de tejido vivo presente.
   3. Para medir la función tisular, coloque omenta (n = 3) en pocillos separados de una placa de 24 pocillos que contenga 500 μl de medio DME/F12 con 20% de FCS. Deje que omenta acondicionen el medio a 37 °C en un entorno con 5% de CO₂ durante 24 horas y luego elimine 250 μl para su uso en un ensayo ELISA de IL-6.
2. Cocultivo ex vivo del epiplón de ratón con células SKOV3ip.1-GFP
   1. Cultive y prepare células marcadas con fluorescencia pipeteando 1x10⁶ células descongeladas en 10 ml de medio en un matraz T-75. Permita que las células crezcan a 37 °C en un entorno con 5% de CO₂ hasta que alcancen el 70% de confluencia. Tripsinizar y resuspender a una concentración de 2 x 10⁶ células por ml.
   2. Aplique ~6 μl del adhesivo tisular a la membrana del inserto de cultivo y deje que se seque al aire. Lave la membrana dos veces con agua estéril para eliminar el exceso de adhesivo. Secar al aire las membranas bajo una cubierta laminar.
   3. Extraiga con cuidado el omenta y fíjelo a la membrana recubierta de adhesivo con pinzas estériles. Deje que el tejido se adhiera a la membrana durante 1 minuto antes de agregar el medio. Agregue 500 μl de la suspensión celular encima de cada epiplón en cada inserto de cultivo. Llene el área alrededor de la cámara de transpocillos con 2,5 ml de DME/F-12 .
   4. Incubar omenta con suspensión celular durante 6 horas a 37 °C en un entorno con 5% de_CO2. Retire y lave cuidadosamente el omenta con ~ 10 ml de PBS. Visualice los focos de células cancerosas fluorescentes utilizando un sistema de imágenes fluorescentes adecuado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramientas de disección	Herramientas de Bellas Ciencias	Na
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% de formalina	sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	21-040-CV	Sin calcio y magnesio
colagenasa	Worthington	LS004196
Inserto de placa de cultivo de milicélulas	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240