Obtención de células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas: un método para cultivar células epiteliales de cáncer de ovario a partir de muestras de tumores de ovario

Resumen

Fuente: Pribyl, L. J. et al. Método para obtener células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas. J. vis. exp. (2014)

En este video, describimos un método para aislar y caracterizar células de cáncer de ovario primario a partir de muestras sólidas de tejido tumoral de ovario. Las células epiteliales de cáncer obtenidas mediante este protocolo son adecuadas para comprender los procesos que pueden conducir a la iniciación y el desarrollo del cáncer de ovario.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Procesamiento de tejidos

1. Trabajando en condiciones estériles, transfiera las muestras a una placa de Petri (60 mm x 60 mm) que contenga 10 ml de PBS fresco y helado y utilice una cuchilla de afeitar estéril, córtelas en los trozos más pequeños posibles (2 mm o menos) (Figuras 1A y 1B).
2. Transfiera los tejidos picados a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de dispasa II (2,4 U/ml) precalentada (37 °C durante 30 min) en DMEM e incube al 5% de CO₂ y 37 °C durante 30 min. Para asegurar una digestión óptima de las muestras, agite manualmente la suspensión celular cada 5 minutos.
3. Después de 30 minutos de incubación, transfiera (con una pipeta serológica de 10 ml) la suspensión celular a un colador celular (malla de 70 μm) colocado encima de un tubo cónico de 50 ml y aplique una presión suave contra la malla con un émbolo de jeringa. Deseche cualquier tejido no disociado (que quede en la parte superior de la malla) y recoja la suspensión celular obtenida en el tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 x g durante 7 min a 4 °C (Figura 2).
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de DMEM que contenga un 10% de FBS.
5. Incubar la suspensión celular en una placa de Petri al 5% de CO₂ y 37 °C (Figura 3).
6. Cambie el medio después de 24 horas desde el recubrimiento inicial. Esto permite la eliminación de los restos celulares y de la mayoría de los eritrocitos presentes en el cultivo.
7. Cambie el medio cada tres días durante las dos semanas siguientes, después de lo cual los cultivos de EOC primario están listos para aplicaciones posteriores.

Resultados

Figura 1. Procesamiento de muestras clínicas. A) Muestra sólida transferida a una placa de Petri que contiene 10 ml de PBS fresco y helado 1x. B) Muestras clínicas cortadas en trozos de unos 2 mm de tamaño

Figura 2. Sepa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x PBS, estéril	Invitrogen	14190-144
Tapa de rosca, espécimen de polipropileno envase, estéril	Termo Científico
Medio DMEM, estéril	Invitrogen	11995-065
Suero fetal bovino, estéril	Hyclone Thermo Scientific	SH30396.03
100x Penicilina-estreptomicina, líquida	Invitrogen	Números 15140-122
Dispasa II, estéril	Roche	04942 078 001
Pinzas pequeñas de punta fina y bisturí cuchilla estéril	Fisher Científico	pinzas: 08-953E, cuchillas: 08-927-5D
Tijeras de disección pequeñas, estériles	Fisher Científico	08-945
15 ml Tubos cónicos con tapón, estériles	Halcón BD	352097
50 ml Tubos cónicos con tapón, estériles	Halcón BD	352027
10 ml Pipeta serológica, estéril	Corning	13-678-11E
6 ml Émbolo de jeringa, estéril	Tyco Cuidado de la Salud	8881516911
Filtro de nylon (70 μm) filtro de celdas, estéril	Halcón BD	352350
Placa de Petri de 5 cm, estéril	Corning	430166
Placa de Petri de 10 cm, estéril	Corning	430167