Obtención de células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas: un método para cultivar células epiteliales de cáncer de ovario a partir de muestras de tumores de ovario

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Procesamiento de tejidos

1. Trabajando en condiciones estériles, transfiera las muestras a una placa de Petri (60 mm x 60 mm) que contenga 10 ml de PBS fresco y helado y utilice una cuchilla de afeitar estéril, córtelas en los trozos más pequeños posibles (2 mm o menos) (Figuras 1A y 1B).
2. Transfiera los tejidos picados a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de dispasa II (2,4 U/ml) precalentada (37 °C durante 30 min) en DMEM e incube al 5% de CO₂ y 37 °C durante 30 min. Para asegurar una digestión óptima de las muestras, agite manualmente la suspensión celular cada 5 minutos.
3. Después de 30 minutos de incubación, transfiera (con una pipeta serológica de 10 ml) la suspensión celular a un colador celular (malla de 70 μm) colocado encima de un tubo cónico de 50 ml y aplique una presión suave contra la malla con un émbolo de jeringa. Deseche cualquier tejido no disociado (que quede en la parte superior de la malla) y recoja la suspensión celular obtenida en el tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 x g durante 7 min a 4 °C (Figura 2).
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de DMEM que contenga un 10% de FBS.
5. Incubar la suspensión celular en una placa de Petri al 5% de CO₂ y 37 °C (Figura 3).
6. Cambie el medio después de 24 horas desde el recubrimiento inicial. Esto permite la eliminación de los restos celulares y de la mayoría de los eritrocitos presentes en el cultivo.
7. Cambie el medio cada tres días durante las dos semanas siguientes, después de lo cual los cultivos de EOC primario están listos para aplicaciones posteriores.

Figura 1. Procesamiento de muestras clínicas. A) Muestra sólida transferida a una placa de Petri que contiene 10 ml de PBS fresco y helado 1x. B) Muestras clínicas cortadas en trozos de unos 2 mm de tamaño

Figura 2. Separación de células EOC de tejidos no disociados. Después de la digestión enzimática, las muestras clínicas se transfieren a un filtro de células y se aplica una presión suave sobre las muestras clínicas digeridas mediante el uso de un émbolo de jeringa. Esto permite el desprendimiento mecánico de la EOC de los tejidos conectivos y la recuperación de las células EOC

Figura 3. Recubrimiento de la suspensión de las células EOC resultantes. Después de eliminar los tejidos no disociados, la suspensión celular se centrifuga y se resuspende en 10 ml de DMEM que contiene un 10% de FBS y se incuba en una placa de Petri al 5% de CO2 y a 37 °C