1. Formación de esferoides de células de cáncer de ovario
- Las células de cáncer de ovario que expresan RFP se cultivan en un medio base al 10 % (un medio de cultivo celular personalizado que contiene una mezcla 50:50 de 199 y MCDB105, 10 % de suero fetal bovino inactivado y 1 % de pen-streptococo). Para expresar RFP en células de cáncer de ovario no marcadas, transfecte las células con un plásmido que contenga RFP y seleccione las células que expresan RFP. Alternativamente, los vectores virales se pueden usar para expresar proteínas fluorescentes transitoriamente, o las células se pueden preincubar con un tinte rastreador de células fluorescentes rojas (Invitrogen).
- Antes de formar esferoides de cáncer de ovario, es necesario preparar placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos de baja adherencia. Para producir placas de cultivo de baja adherencia, agregue 30 μL de solución de poli-HEMA (6 mg de polihidroxietilmetacrilato en 1 ml de EtOH al 95%) a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Las placas de 96 pocillos se incuban en una incubadora no humidificada a 37 °C para evaporar el etanol, dejando una película de poli-HEMA en cada pocillo. Esta película de poli-HEMA evita que las células se adhieran al fondo del pocillo, lo que obliga a las células a crecer en suspensión. [Alternativamente, se pueden utilizar placas de cultivo de fijación ultra baja (Corning).]
- A continuación, tripsinífero las células de cáncer de ovario, granule las células en una centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF durante 3 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender en medio base al 10%.
- Cuente las células con un hemocitómetro.
- Ajuste la concentración de células de modo que haya 100 células por cada 50 μL de medio base al 10%.
- Añada 50 μL de la suspensión celular diluida uniformemente suspendida a cada pocillo de la placa de cultivo recubierta de poli-HEMA de 96 pocillos.
- Incubar la placa de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 16 horas (esta cantidad de tiempo debe aumentarse o disminuirse dependiendo de la cantidad de tiempo que le tome a una línea celular en particular formar esferoides multicelulares o las condiciones experimentales deseadas) para permitir que las células de cáncer de ovario se agrupen, formando un solo esferoide multicelular en cada pocillo. Algunas células tumorales pueden sufrir apoptosis durante este período, por lo que es esencial elegir un momento antes de la inducción de la apoptosis.
>2. Formación de monocapas de células mesoteliales
- En una campana de cultivo celular, recubra previamente los pocillos de una placa MatTek de 6 pocillos con fondo de vidrio con fibronectina agregando 2 mL de una solución de 5 μg de fibronectina/mL de PBS a cada pocillo de la placa e incubando a temperatura ambiente durante 30 minutos. La calidad óptica de los fondos de vidrio de las placas MatTek permite obtener imágenes microscópicas de alta resolución.
Las - células mesoteliales que expresan GFP se cultivan en un medio base al 10%. Tripsinizar una placa de células mesoteliales, girar hacia abajo en una centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RPM durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y volver a suspender en medio base al 10%. Las células mesoteliales utilizadas aquí ya expresaban GFP cuando se obtuvieron, pero las células mesoteliales no marcadas se pueden producir mediante transfección con un plásmido que contenga ADNc GFP o preincubando las células en un colorante rastreador de células fluorescentes verdes (Invitrogen).
- Después de la incubación de 30 minutos de fibronectina (en el paso 2.1), lave los pocillos del plato MatTek con 2 mL de PBS.
- Aspire el PBS y coloque una placa de 6 x 105 celdas mesoteliales por pocillo en cada pocillo de la placa MatTek de 6 pocillos. Incubar la placa MatTek en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante la noche para permitir que las células mesoteliales se adhieran a la placa y formen una monocapa.
>3. Ensayo de aclaramiento de células mesoteliales
- Utilice una pipeta para recoger los esferoides del cáncer de ovario de la placa recubierta de poli-HEMA de 96 pocillos.
- Aspire el medio de un pocillo de la placa MatTek de 6 pocillos que contiene una monocapa de celda mesotelial. Lavar una vez con 2 mL de PBS. Agregue todos los esferoides de la placa de 96 pocillos a un pocillo de la antena MatTek (~ 3 veces el número de esferoides que se van a fotografiar para tener en cuenta los esferoides que aterrizan en la parte de la placa que no se puede fotografiar).
- Coloque la antena MatTek en la platina de un microscopio de fluorescencia de campo amplio invertido capaz de realizar imágenes de lapso de tiempo durante al menos 8 horas. Utilice una platina motorizada para obtener imágenes de múltiples posiciones en el plato, con múltiples eventos de intercalación de esferoides, en un solo experimento. Utilizamos un microscopio de lapso de tiempo de fluorescencia de campo amplio motorizado invertido Ti-E de Nikon con sistema de enfoque perfecto integrado y óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) de baja [apertura numérica (NA] [20x-0,75] y un transiluminador halógeno de Nikon con condensador de larga distancia de trabajo (LWD) de 0,52 NA, filtros de excitación y emisión rápidos (tiempo de conmutación de <100 milisegundos) de Nikon (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 EM 640/50), obturadores inteligentes de trayectoria luminosa de epifluorescencia y transmisión rápida de Sutter, una platina motorizada codificada linealmente de Nikon, una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) refrigerada Hamamatsu ORCA-AG, una cámara de incubación de microscopio personalizada con control de temperatura yCO2, software Nikon NIS-Elements AR versión 3 y una mesa de aislamiento de vibraciones TMC.
- Los esferoides de las células de cáncer de ovario se asentarán en el fondo de la placa y se unirán a la monocapa de células mesoteliales. Recopile imágenes GFP, RFP y de fase de 20+ interacciones esferoide/monocapa cada 10 minutos, durante 8 horas.
- Los esferoides de células de cáncer de ovario que expresan RFP invadirán la monocapa de células mesoteliales que expresan GFP, creando un agujero en la monocapa. Después de 8 horas, mida los tamaños de los agujeros trazando los agujeros negros en las imágenes GFP utilizando el software Elements (u otro software adecuado como la imagen J). Normalice el tamaño del agujero al tamaño inicial del esferoide dividiendo el tamaño del agujero a las 8 horas por el tamaño del esferoide en la imagen RFP correspondiente en el tiempo cero. En este ejemplo, el tamaño del agujero solo se midió una vez, pero se puede medir varias veces a lo largo del experimento de ocho horas para comprender mejor la dinámica de la intercalación.
