Determinación de la frecuencia óptima del campo de tratamiento inhibitorio de tumores para células cancerosas: un método in vitro no invasivo para evaluar el efecto de TTFields en la viabilidad de las células cancerosas

Resumen

Fuente: Porat, Y. et al. Determinación de la frecuencia inhibitoria óptima para las células cancerosas utilizando campos de tratamiento de tumores (TTFields). J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el efecto de la aplicación de TTField en el crecimiento de líneas celulares de cáncer de ovario in vitro. Este ensayo puede ayudar a determinar la frecuencia óptima del campo eléctrico que puede conducir a una reducción máxima en el número de células cancerosas.

Protocolo

1. Sistema de aplicación in vitro TTFields - Mantenimiento de placas base y platos

1. Enjuague los platos y las tapas de los platos con agua corriente del grifo. Luego, enjuague con agua desionizada y seque al aire boca abajo.
2. Si se ha añadido un agente quimioterapéutico/fármaco a los platos en un experimento anterior, llene cada plato con una solución de detergente ligero al 5% y déjelo toda la noche.
   1. Enjuague bien los platos con agua corriente del grifo para evitar cualquier rastro de detergente dentro del plato. Enjuague los platos y las tapas de los platos con agua desionizada y séquelos al aire boca abajo.
3. Inserte los platos limpios y secos con sus tapas en bolsas de esterilización. Selle y coloque las bolsas en un autoclave, con los platos boca abajo. Autoclave durante 30 min a no más de 121 °C.
4. Ponga el autoclave en un programa seco, abra parcialmente la puerta del autoclave y seque los platos durante 30 minutos.
5. Limpie la placa base con un paño ligeramente humedecido con etanol al 70%.

>2. Configuración del experimento

NOTA: Todos los equipos y materiales utilizados en este protocolo se describen en la Lista de Materiales. Todos los pasos a continuación deben realizarse dentro de una cabina de flujo laminar mientras se mantienen las condiciones estériles.

1. Prepare platos y tapas TTFields limpios y estériles, como se describe en la sección 1. Limpie la placa base con un paño ligeramente humedecido con etanol al 70%.
2. Instale los platos TTFields con las tapas en la placa base presionando suavemente el plato y girándolo en el sentido de las agujas del reloj unos 5 mm hasta que el borde del plato encaje en los tres pasadores de la placa base. Coloque un cubreobjetos estéril de 22 mm (plástico o vidrio tratado) en el fondo de cada plato.
3. Prepare la suspensión celular en un medio de crecimiento completo (medio Eagle modificado de Dulbecco para U-87 MG y F98; RPMI para A2780 y OVCAR-3; complementado como se describe en la Lista de Materiales).
   NOTA: Las concentraciones de células dependen de los tipos de células y de la duración del experimento; El 80%-90% de crecimiento de células confluentes no debe excederse al final del experimento.
   PRECAUCIÓN: Las líneas celulares humanas pueden representar un peligro biológico y deben manipularse con las medidas de seguridad adecuadas.
4. Coloque 200 μL de suspensión celular (generalmente 5,000-20,000 celdas en 200 μL para un experimento de 72 horas, dependiendo del tiempo de duplicación) como una gota en el centro de cada cubreobjetos y cúbralo con las tapas de los platos.
5. Incubar a 37 °C en una incubadora de CO₂ hasta que las células se adhieran; en esta etapa es posible una incubación nocturna.
6. Aspire los fluidos de la gota con una pipeta de 200 o 1.000 μL.
7. Pipetear suavemente 2 ml de medio de crecimiento completo para llenar cada plato. Use una punta estéril para pipetear y golpee suavemente los bordes del cubreobjetos para liberar las burbujas de aire que ocasionalmente quedan atrapadas debajo del portaobjetos.
8. Cubra los platos con sus tapas y colóquelos dentro de una incubadora de CO₂ a 37 °C hasta el inicio del tratamiento TTFields.

3. Aplicación TTFields

1. Transfiera las placas base con las placas TTFields adjuntas a una incubadora refrigerada de_CO2.
   NOTA: La aplicación in vitro de TTFields generará calor; Por lo tanto, se requiere una incubadora refrigerada para compensar el calentamiento de los platos. Las intensidades más altas de TTFields producirán más calor y requerirán temperaturas ambiente más bajas en la incubadora (consulte la Tabla 1). Las intensidades de TTFields clínicamente relevantes se alcanzan cuando la temperatura de la incubadora para la aplicación de TTFields está en el rango de 18-30 °C.
2. Conecte el conector hembra del cable plano a la placa base. Encienda el generador TTFields.
3. Inicie el software del sistema de aplicación in vitro TTFields y seleccione la configuración del experimento.
   1. Defina un nuevo experimento. Escriba el nombre del experimento y el propietario del experimento en la interfaz de usuario del software en la pantalla del equipo. Ajuste la frecuencia y la temperatura objetivo para cada plato o placa base.
4. Inicie la aplicación TTFields utilizando el software.
5. Verifique que todos los platos estén conectados correctamente y aparezcan en azul claro en el monitor. Si un plato está rodeado por un círculo rojo (lo que significa que no está conectado correctamente), presiónelo suavemente y gírelo lentamente hacia adelante y hacia atrás hasta que se restablezcan los contactos y el plato aparezca azul claro.
6. Deje el sistema de aplicación in vitro TTFields funcionando hasta 24 h.
7. Si el experimento llega a su punto final, deténgalo haciendo clic en el botón FINALIZAR EXPERIMENTO en el software y continúe con el paso 5. Si no es así, haga clic en PAUSAR experimento.
8. Desconecte el conector de cable plano de la placa base. Retire la placa base con las placas de la incubadora y colóquela en una cabina de flujo laminar.
9. Reemplace el medio en todos los platos cada 24 h y devuelva la placa base a la incubadora refrigerada. Conecte la placa base al generador mediante el cable plano. Continúe el experimento haciendo clic en el botón CONTINUAR.

Temperatura ambiente de la incubadora	Intensidades esperadas de TTFields
(°C)	(V/cm RMS)
18	1.62
19	1.55
20	1.48
21	1.41
22	1.33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0.97
28	0.9
29	0.83
30	0.76

Tabla 1. Temperatura ambiente de la incubadora e intensidades esperadas de TTFields dentro de la placa TTFields.

>4. Muestras de control

Nota: Cultive células de control en condiciones similares a las células tratadas con TTFields, excluyendo la aplicación de TTFields.

1. Placas de control de muestras con la misma suspensión y en una superficie similar que se utiliza para el recubrimiento de muestras tratadas con TTFields.
2. Coloque las placas de control en una incubadora de_CO2 a 37 °C.
3. Reemplace el medio en los platos cada 24 h para que coincida con las condiciones del medio del plato tratado con TTFields.

5. Fin del experimento

1. Después de hacer clic en FINALIZAR EXPERIMENTO, espere a que el software recupere todos los registros del sistema y guarde los registros en la computadora.
2. Utilice el botón INFORMES para revisar los archivos de registro de temperatura, corriente y resistencia de cada placa base para verificar que todos los platos se trataron de acuerdo con el plan experimental><. NOTA: Todos los informes y registros se guardan en el ordenador una vez finalizado el experimento y se pueden revisar en cualquier momento.
3. Apague el generador TTFields.
4. Desconecte el cable plano de la placa base y retírelo de la incubadora.
5. Para quitar un plato de cerámica, presione hacia abajo y gire el plato en sentido contrario a las agujas del reloj para desbloquearlo de la placa base.
6. Lleve los platos a una cabina de flujo laminar y retire asépticamente los cubreobjetos. Transfiéralos a placas de Petri estériles que contengan medio fresco o solución salina tamponada con fosfato (PBS) para su posterior inspección y evaluación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema y software Invitro	Novocure	ITG1000 y IBP1000	Cada unidad contiene 1 generador TTFields, 1 placa base, 8 antenas TTFields con tapas y 1 cable plano.
Bolsas de esterilización	Westfield medica	24882
Correderas de cubierta de plástico	Termo Científico (NUNC)	174977	Pre tratado y esterilizado
Correderas con cubierta de vidrio	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	Esterilizar si es necesario
El medio del Eagle modificado de Dulbecco	Industrias Biológicas (Israel)	01-055-1A	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar
Suero fetal bovino (FBS)	Industrias Biológicas (Israel)	04-007-1A	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pluma/estreptococo (10,000 U/mL de penicilina, 10,000 μg/mL de estreptomicina)	Gibco	Números 15140-122
Solución de piruvato sódico 100 mM	Industrias Biológicas (Israel)	03-042-1B
Tampón Hepes 1 M	Industrias Biológicas (Israel)	03-025-1B
Solución de insulina de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0,25% Tripsina/EDTA	Industrias Biológicas (Israel)	03-050-1B	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar
metanol	Merck	1.06009.2511	Enfriar a -20 °C en el congelador antes de usar
Pbs	Industrias Biológicas (Israel)	02-023-1A	Sin calcio y magnesio
A2780	ECACC (en	93112519	Crecer en RPMI 1640 suplementado con FBS (10%), pen/estreptococo (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sodio (1 mM) y tampón Hepes (12 mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Crecer en el medio Eagle's modificado de Dulbecco suplementado con FBS (10%), pluma/estreptococo (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sodio (1 mM) y glutamina (2 mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Crece en RPMI 1640 suplementado con FBS (20%), pen/estreptococo (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sodio (1 mM), tampón Hepes (12 mM) e insulina (10 μg/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Crece en el medio Eagle's modificado de Dulbecco suplementado con FBS (10%), pen/estreptococo (100 U/mL / 100 μg/mL), piruvato de sodio (1 mM) y glutamina (2 mM).
incubadora de CO2 refrigirada	Caron	7404-10-3
Cabina de flujo laminar	ADS Laminair	Bio12 y VSM12