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Todos los procedimientos que involucran embriones de huevo de gallina han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparando los huevos
- Antes de recibir los huevos, ensamble y equilibre la incubadora de huevos a 37.8 °C (100 °F) con 60-70% de humedad siguiendo las instrucciones del fabricante><.
nota: Para minimizar los riesgos de contaminación, se puede utilizar agua esterilizada en autoclave para controlar la humedad.
- Al recibir huevos de gallina Rhode Island Red fertilizados de un proveedor de huevos certificado de laboratorio, limpie en seco la superficie de las cáscaras con toallas de papel. Se puede usar una toalla de papel ligeramente humedecida para eliminar el material adherido. Secar inmediatamente.
nota: Mojar la cáscara con líquido por debajo de 43,3 °C puede introducir bacterias en el huevo. Si se opta por lavar o desinfectar los huevos, la temperatura del líquido debe estar entre 43,3 y 48,9 °C. Las temperaturas más altas pueden hervir los huevos. La elección del desinfectante debe hacerse en función de los microorganismos que causan preocupación.
- Usa un lápiz o marcador para etiquetar la fecha en el huevo. Esto se considera día de desarrollo 0.
- Coloque los huevos en la incubadora de huevos e incube durante al menos 7 días con rotación para permitir el desarrollo de CAM. Se puede utilizar un rotador automático, o los huevos se pueden rotar 180° 2-3 veces por día.
2. Abriendo los huevos
NOTA: La apertura de los huevos debe realizarse cuando la CAM se haya desarrollado completamente. Esto suele ser el día 7 u 8 de desarrollo.
- Desinfectar una cabina de bioseguridad con etanol al 70%. Del mismo modo, desinfecte y coloque en el gabinete de bioseguridad un estante para huevos, un candelabro para huevos, un marcador, una herramienta rotativa inalámbrica con una piedra de moler de carburo de silicio y una rueda de corte circular, una aguja de 18 G, un controlador de pipeta con tubo de vacío de un cuarto de pulgada, cinta de embalaje, tijeras de oficina, tijeras curvas, pinzas Semken (o similares), bolas de algodón y apósito de película transparente de 6 x 7 cm. Siempre que sea posible, utilice herramientas estériles, desechables o esterilizadas en autoclave.
- Apague el rotador de huevos. Coloque aproximadamente 1-3 huevos en el gabinete de bioseguridad en el estante para huevos. Mientras está en la oscuridad, coloque el candelabro de huevos contra la cáscara del huevo para identificar la celda de aire. Marque la ubicación de la celda de aire.
nota: La intensidad de la iluminación del candelabro de huevos es crucial para visualizar el interior del huevo. Si la celda de aire o la vasculatura son consistentemente difíciles de ver, intente reemplazar las baterías del vela de huevo.
- Mueva el candelabro de huevos sobre la cáscara para encontrar una red grande de vasos sanguíneos. Gire el huevo si es necesario. Una vasculatura ideal será ramificada cerca de la mitad del huevo. Utilice un marcador para dibujar sobre la vasculatura que se utilizará para la implantación.
- Enciende la luz del capó. Con una herramienta rotativa inalámbrica equipada con una piedra abrasiva de carburo de silicio, taladre un pequeño orificio en la carcasa directamente sobre el centro de la celda de aire. Taladre hasta que se haya quitado la mayor parte de la cáscara, pero la membrana interna blanca esté intacta.
nota: La perforación sobre la celda de aire antes de apuntar a la vasculatura permite determinar el grosor de esa cáscara de huevo en particular sobre la celda de aire en lugar de sobre la CAM y la vasculatura. Si se interrumpe la MCA o la vasculatura, el óvulo no es utilizable para la implantación.
- Taladre y abra otro pequeño orificio donde se abrirá la ventana vascular como se hizo para la celda de aire (paso 2.4).
- Con una aguja de 18 G, perfore suavemente la membrana interna blanca sobre la celda de aire y la vasculatura. Si no puede penetrar el caparazón, perfore con cuidado un poco más. Asegúrese de que la membrana interna blanca (pero no la CAM) se rompa en toda el área perforada. No es necesario retirar la pieza de la membrana.
nota: Si la MCA o la vasculatura se alteran durante este paso, desecha el huevo. El daño es evidente si hay sangre o albúmina que se escapa de un orificio perforado.
- Apague la luz del capó. Con el candelabro de huevos, verifique que la celda de aire se transfirió desde el extremo del huevo hasta el área sobre la vasculatura. Si es necesario, coloque el tubo de vacío insertado en un controlador de pipeta alrededor del orificio sobre la celda de aire original y aplique suavemente la succión en ráfagas cortas para mover la celda de aire.
- Utilice un marcador para delinear la nueva ubicación de la celda de aire aproximadamente 0,5 cm dentro del límite de la cámara de aire. Coloque un trozo de cinta de embalaje justo encima de la nueva celda de aire. Si es necesario, use tijeras de oficina estándar para recortar la cinta a un tamaño apropiado.
nota: La cinta puede interrumpir el flujo de aire a través de la carcasa y no debe ser más grande de lo necesario para cubrir completamente la celda de aire.
- Regrese los huevos a la incubadora para que se calienten sin rotación con la nueva celda de aire hacia arriba. Repita los pasos 2.2-2.9 para abrir los huevos restantes.
nota: El protocolo puede estar en pausa aquí. Si no está seguro de la calidad del desarrollo de la CAM, se debe realizar un pequeño número de óvulos en el paso 2.16 antes de abrir los huevos restantes.
- Coloque aproximadamente 1-3 huevos con celdas de aire reubicadas en el estante de huevos en el gabinete de bioseguridad.
nota: Se debe tener cuidado para evitar introducir contaminación en el huevo abierto. Por lo tanto, siempre abra los huevos dentro de un gabinete de bioseguridad y use herramientas y equipos estériles siempre que sea posible.
- Con una herramienta rotativa inalámbrica equipada con un disco de corte circular, corte una pequeña línea sobre el límite de la celda de aire dibujado en el paso 2.8. Asegúrese de que esté aproximadamente 0,5 cm dentro del límite real de la CAM de aire para evitar interrumpir la CAM o la vasculatura. Corte completamente a través de la cáscara, pero tenga cuidado de no penetrar lo suficientemente profundo como para interrumpir la CAM o la vasculatura.
- Con unas tijeras curvas, corte alrededor de la celda de aire restante para crear una ventana en el caparazón.
nota: Si hay sangre o membrana en la cáscara extraída, entonces el óvulo no es adecuado para la implantación. Si una alta proporción de los huevos no se abren limpiamente, considere esperar al menos 1 día adicional para abrir los huevos restantes para permitir una mejor formación de CAM. Si las cáscaras de los huevos restantes no han sido perforadas, se debe reanudar la rotación de los huevos dentro de la incubadora.
- Verificar la viabilidad del embrión. Los embriones viables mostrarán una vasculatura extensa, albúmina clara, movimiento embrionario o un latido cardíaco visible.
- Con unas pinzas Semken, extraiga pequeños trozos de algodón de una bola de algodón estéril. Seque suavemente la superficie CAM para eliminar el polvo y los residuos de la cáscara.
nota: La remoción de escombros debe realizarse el mismo día que se abren los huevos.
- Cubra la abertura de la carcasa con un cuarto de trozo de apósito de película transparente de 6 x 7 cm.
- Regrese los huevos a la incubadora. Asegúrese de que el huevo se asiente de forma segura con la ventana abierta hacia arriba y que la CAM no toque el apósito de película transparente. Use un trozo de rejilla para huevos, el borde del rotador de huevos u otro elemento adecuado para apoyar los huevos que sigan rodando.
- Repita los pasos 2.10-2.16 para abrir todos los huevos restantes.
nota: No es necesario que la apertura de los óvulos se complete el mismo día de la implantación. Esperar al menos 1 día puede ayudar a eliminar los huevos cuya viabilidad se vio comprometida al abrir la cáscara.