Modelado de cáncer basado en membrana corioalantoidea de pollo: un modelo in ovo para estudiar la tumorigénesis y la metástasis de las células cancerosas

Resumen

Fuente: Sharrow, A. C. et al. Utilizando el modelo in vivo de membrana corioalantoidea de pollo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos. J. Vis. Exp.(2020)

En este video, describimos la implantación de células cancerosas en una membrana corioalantoidea de pollo para generar un modelo in ovo. El modelo injerta con éxito las células de cáncer de ovario para estudiar la progresión del cáncer ginecológico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de la suspensión de células cancerosas para el trasplante (opción 1)

NOTA: Esto debe completarse justo antes de la implantación, que idealmente debería tener lugar entre los días 7 y 10. Consulte las notas al principio del paso 3 o 4 para obtener más información sobre la fecha de implantación. Este enfoque se utilizó para todas las líneas celulares y los digestión de tumores de cáncer de riñón cultivados.

1. Descongele la solución de matriz extracelular con hielo.
2. Mediante digestión mecánica y/o enzimática, obtener una suspensión unicelular utilizando un método adecuado para el tipo de célula que se implanta.
3. Resuspender el número total de células que se van a implantar en un medio adecuado para la implantación. Son típicos los implantes de 1-2 x 10⁶ células por óvulo.
   nota: El medio utilizado para la implantación de las líneas celulares suele ser el medio completo utilizado para el cultivo de las células, que contiene FBS o reemplazo de suero. La implantación de digestión tumoral generalmente utiliza el medio completo utilizado para cultivar líneas celulares del mismo tipo de cáncer. Sin embargo, se pueden realizar ajustes experimentales en la formulación del medio. Los efectos sobre el desarrollo y crecimiento tumoral tendrían que determinarse empíricamente.
4. Granule las celdas utilizando una velocidad de centrífuga y un tiempo apropiados para las celdas que se están utilizando. Las velocidades típicas son de 250-300 x g, y los tiempos son de 5-10 min.
5. Retire el sobrenadante de las células peletizadas mediante pipeteo. Resuspensión mecánica de las células en el medio residual mediante flicking o pipeteo. Coloque sobre hielo para que se enfríe. Mida el volumen de las células y el medio con una pipeta del tamaño adecuado.
6. Calcule los volúmenes de implantación de manera que se implanten 1-2 x 10⁶ células en un volumen de 20-100 μL por huevo con una concentración final de la matriz extracelular de 2,7-4 mg/mL de proteína. Agregue el medio, los factores de crecimiento o aditivos deseados y la solución de matriz extracelular de acuerdo con este cálculo. Manténgalo en hielo hasta que esté listo para implantar.
   nota: Para los cálculos de los pasos 1.3 y 1.6, se debe incorporar un volumen adicional de al menos medio implante de óvulos para garantizar un volumen adecuado para todos los óvulos del grupo. Para la implantación de las líneas celulares de cáncer de ovario (es decir, SKOV3 e ID8), se implantaron 10^{a 6} células por óvulo. Para la implantación de la línea celular de carcinoma de células renales RENCA, células cultivadas derivadas de carcinoma primario de células renales humanas digeridas, líneas celulares de cáncer de próstata (es decir, CWR, C4-2 y MyC-CaP) y líneas celulares de cáncer de vejiga (es decir, HT-1376 y T24), se implantaron 2 x 10⁶ células.

>2. Preparación de piezas tumorales para la implantación (opción 2)

>NOTA: Esto debe completarse justo antes de la implantación, que idealmente debería tener lugar entre los días 7 y 10. Consulte las notas al principio del paso 3 o 4 para obtener más información sobre la fecha de implantación. Los cánceres primarios de ovario y vejiga se implantaron como piezas tumorales.

1. Descongele la solución de matriz extracelular con hielo. Diluir hasta una concentración final de proteína de 2,7-4 mg/mL en un medio apropiado que contenga los factores de crecimiento o aditivos deseados. Mantener en hielo.
   nota: La implantación de piezas tumorales generalmente utiliza el medio completo utilizado para cultivar líneas celulares del mismo tipo de cáncer. Sin embargo, se pueden realizar ajustes experimentales en la formulación del medio. Los efectos sobre el injerto tumoral y el crecimiento tendrían que determinarse empíricamente.
2. Con un bisturí o unas tijeras, extirpe los trozos del tumor fresco. Los tamaños ideales oscilan entre 2 y 5 mm en cada lado. Mantenga los tejidos sumergidos en el medio hasta que estén listos para el implante.

>3. Implantación mediante anillo antiadherente (opción 1)

NOTA: Las células pueden ser implantadas a partir del día 7 de desarrollo si la CAM está completamente desarrollada. La implantación puede ocurrir en cualquier momento antes de la eclosión, lo que permite el tiempo adecuado para el desarrollo del tumor y el experimento deseado, pero tenga en cuenta que las células inmunitarias del embrión comienzan a estar presentes alrededor del día 10 después de la fertilización. La tasa de crecimiento tumoral varía considerablemente según el tipo de célula y debe determinarse empíricamente para el tipo de célula de interés. El cáncer de ovario y las células de cáncer de próstata se implantaron mediante el método de anillo antiadherente. Tenga en cuenta que cuando no se dispone de un anillo antiadherente, se puede cortar una punta de pipeta de un tamaño similar y utilizarla.

1. Utilice etanol al 70% para desinfectar un gabinete de bioseguridad y todas las herramientas necesarias: un estante para huevos, pinzas de iris curvadas, anillos antiadherentes (diámetro interior de 1/4 de pulgada), varilla de agitación de vidrio, pipetas y puntas de volumen adecuado, apósito de película transparente de 6 x 7 cm, tijeras de oficina y marcador o lápiz. Siempre que sea posible, se deben utilizar herramientas estériles, desechables o esterilizadas en autoclave.
2. Coloque los huevos para implantarlos en un estante de huevos en un gabinete de bioseguridad. Seleccione una cantidad manejable de huevos. Lo habitual es hasta seis. Evite permitir que los huevos se enfríen sustancialmente mientras trabaja con ellos.
3. Retire el apósito de película transparente de la carcasa enrollando los bordes hacia la ventana abierta para evitar que se desprendan los trozos de la carcasa. Comprueba que los huevos son viables y sanos. Los huevos ideales tendrán un vaso grande en el centro del área abierta con vasos más pequeños que se ramifican desde él.
4. Con pinzas de iris curvadas, coloque un anillo antiadherente estéril en el CAM sobre el vaso, idealmente sobre un punto de ramificación. Use una varilla agitadora de vidrio estéril para desgastar suavemente el CAM.
5. Pipete la suspensión de la celda desde el paso 1.6 en el centro del anillo antiadherente. Alternativamente, use fórceps para colocar una pieza tumoral del paso 2.2 en el centro del anillo antiadherente y cúbrala con 20-50 μL de la solución de matriz extracelular generada en el paso 2.1.
6. Selle la abertura con un cuarto de pieza de apósito de película transparente de 6 x 7 cm. Etiquete los óvulos con una designación de implante adecuada.
   nota: La numeración de los huevos dentro de un grupo facilita las observaciones longitudinales.
7. Regrese el huevo a la incubadora. Asegúrese de que la abertura de la cáscara quede en posición vertical y que el huevo esté seguro.
   nota: Los huevos se pueden devolver a una incubadora de huevos sin rotación. Alternativamente, se puede obtener una alta viabilidad postimplante utilizando una incubadora de células a 37-38 °C con el CO₂ desactivado y un higrómetro para controlar la humedad, que debe ser del 50%-80%.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
010 Teflón (PTFE) Juntas tóricas Blanco 55 Duro Shore D	La tienda de juntas tóricas	TEF010	Anillo antiadherente para siembra de células. 1/4" de diámetro interno X 3/8" de diámetro exterior X 1/16" CS de politetrafluoroetileno (PTFE).
tijeras de operación delicadas; Curvo; agudo-agudo; Longitud de la hoja de 30 mm; 4-3/4 pulg. Longitud total	Roboz Quirúrgico	RS6703	Esto se proporciona a modo de ejemplo. Cualquier tijera curva similar también funcionaría.
Kit de herramientas Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	Dremel	8050-N/18	Este kit contiene todas las herramientas necesarias
Huevos de gallina fertilizados (Rhode Island Red - Brown, grado de laboratorio)	Huevos de laboratorio AA Inc.	N/A	Sería necesario identificar a un proveedor local de huevos, ya que este proveedor solo realiza entregas a nivel regional.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Incubadora de Huevos Combo Kit	Almacén de incubadoras	HB1588D-NINGUNO-1102-1588-1357	Se pueden utilizar otras incubadoras de huevos, pero sería necesario verificar su fiabilidad. Después de la implantación, también se puede utilizar una incubadora de células con el CO2 desactivado.
Vela de huevos Incu-Bright Cool Light	Almacén de incubadoras	Artículo 1102	Se pueden usar otros candelabros, sin embargo, este es el preferido entre los que hemos probado. Esta vela está incluida en el kit de incubadora antes mencionado.
Matrigel Membrana Matrix HC; Libre de LDEV	Corning	354248	Solución de matriz extracelular
SKOV3	ATCC	HTB-77	Línea celular de cáncer de ovario humano.
Varillas de agitación con policía de goma; 5 mm de diámetro, 6 pulgadas de largo	Suministros Científicos Unidos	GRPL06	Esto se proporciona a modo de ejemplo. Cualquier varilla de agitación de vidrio similar también funcionaría.
Pinzas para muestras	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72914	Esto se proporciona a modo de ejemplo. Las pinzas utilizadas para extraer la carcasa para la obtención de imágenes de bioluminiscencia miden aproximadamente 12,8 cm de largo con puntas de 3 mm de ancho.