Ensayo de espín de agarosa: una técnica para incrustar organoides para el análisis histológico

Resumen

Fuente: Lee, S. et al. Establecimiento y análisis de organoides tridimensionales (3D) derivados de muestras de metástasis ósea de cáncer de próstata de pacientes y sus xenoinjertos. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, realizamos un ensayo de espín para incrustar organoides de cáncer de próstata en 3D en agarosa. Estos organoides incrustados se pueden utilizar para análisis histopatológicos posteriores para estudiar el crecimiento y el desarrollo del cáncer.

Protocolo

>1. Procesamiento de organoides para histología: el método de centrifugado de agarosa

>NOTA: Este protocolo es una adaptación de una publicación previa de Vlachogiannis et al. Hemos añadido un paso que implica la inclusión de agarosa para incrustar con éxito todas las poblaciones de organoides.

1. Retire los medios existentes del pozo. Tenga cuidado de no aspirar las cúpulas de la membrana basal.
2. Añada un volumen igual (igual al volumen de medios extraído del paso 1) de la solución de recuperación celular e incube durante 60 minutos a 4 °C.
3. Desaloje la cúpula de la membrana basal con una pipeta y triture la cúpula de la membrana basal con una punta de pipeta. Recoja la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 mL.
4. Centrifugar a 300 x g y 4 °C durante 5 min.
5. Retire el sobrenadante (solución de recuperación de células). Guarde todos los sobrenadantes en tubos separados hasta el final, cuando se confirme la presencia de organoides en el paso final de granulación.
6. Agregue el volumen deseado (Tabla 1) de PBS frío y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para perturbar el pellet mecánicamente.
7. Centrifugar a 300 x g y 4 °C durante 5 min.
8. Retire el sobrenadante (PBS).
9. Fije el pellet en un volumen adaptado (p. ej., 500 μL para un pellet de la condición de cultivo en placa de 24 pocillos, Tabla 1) de PFA al 4% durante 60 min a temperatura ambiente.
10. Después de la fijación, centrifugar a 300 x g y 4 °C durante 5 min.
11. Retire el sobrenadante (PFA).
12. Lavar con el volumen correspondiente (p. ej., 500 μL para un pellet de la condición de cultivo en placa de 24 pocillos, Tabla 1) de PBS y centrifugar a 300 x g y 4 °C durante 5 min.
13. Prepare agarosa tibia (2% de agarosa en PBS).
    nota: Aquí, los gránulos de celda para secciones congeladas se pueden resuspender directamente en 200 μL de compuesto OCT.
14. Vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de agarosa (2% en PBS).
    1. Inmediatamente después de añadir la agarosa, separe suavemente el pellet de celda de la pared del tubo de 1,5 mL con la aguja de 25 G unida a la jeringa de 1 mL. Como se muestra en la Figura 1, si el pellet de la célula no se separa físicamente de la pared del tubo de 1,5 mL, existe el riesgo de perder todo o parte del pellet de la célula durante el proceso de inclusión de la agarosa.
15. Espere hasta que el 2% de agarosa en PBS esté completamente solidificado.
16. Separe el bloque de agarosa solidificada del tubo de 1,5 mL con una aguja de 25 G conectada a la jeringa de 1 mL.
17. Transfiera el bloque de agarosa desprendido que contiene el pellet de celda a un nuevo tubo de 1,5 mL.
18. Llene el tubo con EtOH al 70% y proceda a utilizar el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la inclusión de parafina.

Tabla 1: Densidad de siembra, volumen de la membrana basal y volumen medio necesario para un domo

Placa de cultivo	Densidad de siembra (celdas)	Volumen de la membrana basal (μL)	Medio (μL)
48 pozos	25.000-50.000	20	250
24 pozos	50.000-250.000	40	500
6 pozos	50.000-250.000	40	2.000

Resultados

Figura 1: Un paso clave para una inclusión exitosa de agarosa. Un proceso para separar el pellet de la célula de la pared del tubo de 1,5 mL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de pipeta	Gilson	F123602
Jeringa de 1 ml	Jeringa BD	329654
Tubo de 1,5 ml	Productos de Spectrum Lab	941-11326-ATP083
Aguja 25G	Aguja BD PrecisionGlide	305122
4% Paraformaldehído (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Etanol (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
agarosa	Lonza	50000
Placa de cultivo celular - 24 pocillos	Coprotagonista	3524
Placa de cultivo celular - 48 pocillos	Coprotagonista	3548
Placa de cultivo celular - 6 pocillos	Coprotagonista	3516
Solución de disociación celular, Accumax	Tecnologías Celulares Innovadoras, Inc.	AM105
Solución de recuperación de células	Corning	354253
Raspador de células	Sarstedt	83.18
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
Puntas de pipeta para 1 mL (puntas azules)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Centrífuga de mesa pequeña	ThermoFisher Scientific	75002426
Compuesto OCT	Tejido-Tek	4583
Baño de agua	Fisher Sc	Artículo 2320