>1. Siembra de células epiteliales prostáticas clasificadas en cultivo primario de organoides de ratón — TIEMPO: 2-3 h (excluyendo la preparación de placas recubiertas de poli-HEMA)
NOTA: Las placas están recubiertas con Poly-HEMA para evitar la formación de colonias 2D en la superficie del pozo debajo del gel de la matriz. Prepare las placas recubiertas de Poly-HEMA 1 día antes de la siembra de las células epiteliales de próstata basales o luminales clasificadas en cultivo de organoides de ratón. Descongele 1 ml de alícuotas de gel de matriz de factor de crecimiento reducido, en lo sucesivo denominado gel de matriz, en hielo 2 h antes del paso 1.1. Y-27632 (inhibidor de ROCK) debe añadirse a los medios organoides de ratón inmediatamente antes del paso 1.1. Realice los pasos 1.1-1.8 en hielo.
- Granular las células en tubos de fondo redondo de 5 mL por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
- Lave el pellet de celda en 500 μL de medio organoide de ratón (Tabla 1).
- Granular las células por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender en medio organoide de ratón a una densidad celular de 1.000 células/μL.
- Para preparar mezclas maestras, mezcle células epiteliales suspendidas en medios organoides de ratón con gel de matriz para generar una mezcla final que contenga un 25% de células/medio y un 75% de gel de matriz. Las células basales se siembran normalmente a una concentración de 100-2.000 células/80 μL, mientras que las células luminales se siembran normalmente a una concentración de 2.000-10.000 células/80 μL. La densidad de las celdas chapadas varía según el día de recolección de material previsto y la aplicación posterior deseada.
NOTA: Enfríe los tubos del tamaño adecuado para el volumen esperado de la mezcla maestra 5 minutos antes de la preparación de la mezcla maestra. Para asegurarse de que el gel de matriz no se endurezca durante la manipulación, es fundamental enfriar la punta de la pipeta pipeteando el gel de matriz 3-4 veces antes de transferirlo a un nuevo tubo.
- Agregue 80 μL de la mezcla de gel/célula de la matriz por pocillo de una placa de 24 pocillos. Se recomienda pipetear una gota en la mitad inferior de la pared del pocillo, evitando el contacto directo con el recubrimiento Poly-HEMA. Después de agregar el gel de matriz, agite la placa para permitir que la mezcla de gel de matriz / célula forme un anillo alrededor del borde del pocillo.
- Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C con el lado derecho hacia arriba durante 10 minutos para permitir que el gel de la matriz se endurezca parcialmente.
NOTA: Comience a calentar los medios organoides de ratón a 37 °C inmediatamente después de colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora.
- Después de incubar durante 10 minutos, voltee la placa de 24 pocillos boca abajo e incube durante 50 minutos adicionales para permitir que el gel de la matriz se endurezca por completo.
- Agregue 350 μL de medio organoide de ratón precalentado gota a gota en el centro de cada pocillo.
NOTA: Para mantener la integridad del gel de matriz, es fundamental evitar el anillo de gel de matriz mientras se agregan medios.
- Después de agregar el medio, devuelva la placa de 24 pocillos a la incubadora de 5 % CO2 a 37 °C.
>2. Reposición de medios organoides de ratón — TIEMPO: 10-15 min por placa de 24 pocillos
NOTA: Los medios existentes deben reemplazarse por medios nuevos cada 48 h. Antes de cada cambio de medio, precaliente el medio organoide del ratón. No es necesario añadir un inhibidor de ROCK a los medios utilizados para la reposición.
- Incline la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45° y retire suavemente los medios existentes del centro de cada pocillo con una pipeta P1000 mientras evita el anillo de gel de matriz.
- Añada 350 μL de sustrato organoide de ratón precalentado como en el paso 1.9. Se recomienda añadir un mayor volumen de medios (hasta 1 mL) a los organoides cultivados durante más de 5 días para evitar el rápido agotamiento de nutrientes clave y factores de crecimiento.
Tabla 1: Instrucciones para la preparación de medios organoides de ratón
por
|
componente
| concentración
|
| B-27 | 1x (diluido a partir de 50x concentrado) |
| GlutaMAX | 1x (diluido a partir de 100x concentrado) |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM |
| Normocina | 50 μg/mL |
| EGF humano recombinante, sin animales | 50 ng/mL |
| Noggin Humano Recombinante | 100 ng/mL |
| Medios condicionados con R-espondina 1 | 10% de medios acondicionados |
| A83-01 | 200 nM |
| DHT (Traducción asistida | 1 nM |
| Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avanzado | Medios de base |
| Se genera un medio condicionado con R-espondina 1 como se describe en Drost et al. Después de la adición de todos los componentes, el filtro esteriliza los medios organoides de ratón con un filtro de 0,22 μm. El inhibidor de ROCK solo se agrega durante el establecimiento del cultivo y el paso de organoides. |
