Extracción de lisado de proteínas: una técnica para lisar organoides para recolectar proteínas celulares

Resumen

Fuente: Crowell, P. D. et al. Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón mediante cultivo de organoides. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos la extracción de lisados de proteínas de organoides de próstata cultivados en un anillo de matriz de membrana basal. El análisis de las fracciones proteicas extraídas puede ayudar a estudiar la expresión de marcadores de linaje en los organoides.

Protocolo

1. Extracción de lisado de proteínas de organoides de próstata para el análisis de Western Blot — TIEMPO: 2.5-4 H

NOTA: Antes de recolectar organoides para la extracción de lisado de proteínas, prepare y precaliente medios que contengan dispasas (Tabla 1).

1. Retire el medio de cada pocillo inclinando la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45° y retirando suavemente el medio existente del centro de cada pocillo con una pipeta P1000 mientras evita el anillo de gel de matriz.
2. Para recolectar organoides, frote repetidamente el gel de la matriz pipeteando 1 mL de medio que contenga dispasas directamente sobre el anillo de gel de la matriz hasta que se desprenda todo el anillo y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Es fundamental evitar el contacto directo con los pocillos recubiertos de Poly-HEMA. El contacto directo puede causar la contaminación del material recolectado con Poly-HEMA, lo que podría afectar negativamente la supervivencia celular.
3. Coloque el/los tubo(s) de microcentrífuga de 1,5 mL en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 30 min a 1 h para permitir la digestión completa del gel de la matriz por dispasa.
4. Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante con una micropipeta.
5. Agregue solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la pelletza de organoide y vuelva a suspender moviendo suavemente.
   NOTA: Si no se resuspende suficientemente la pelletza de organoide, se puede contaminar el material organoide con dispasa residual o gel de matriz.
6. Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante con una micropipeta.
7. Congele rápidamente los gránulos de organoides colocando cada tubo en una solución que contenga hielo seco y metanol. Guarde el tubo o tubos hasta su uso futuro a -80 °C. Alternativamente, extraiga el lisado de proteínas inmediatamente después del paso 1.6.
8. Vuelva a suspender los gránulos de organoide en 100 μL de tampón de lisis de proteínas (Tabla 1) por cada 10 μL de volumen de células empaquetadas. Desplácese para volver a suspender.
   NOTA: Si se reanuda después de la congelación rápida, asegúrese de que el tampón de lisis de proteínas se descongele antes de retirar las muestras a -80 °C, ya que el tampón de lisis debe agregarse a las muestras inmediatamente para evitar la actividad de la fosfatasa y la proteasa.
9. Incubar las muestras en tampón de lisis de proteínas en hielo durante al menos 45 min.
   NOTA: Se recomienda sonicar antes de la incubación en hielo para aumentar la eficiencia de la recuperación de proteínas nucleares; Sin embargo, la sonicación no es necesaria. Si no se realiza la sonicación, continúe con el paso 1.10.
   1. Para sonicar, sumerja los tubos en hielo húmedo y aplique suavemente la punta del desmembrador sónico al tubo de microcentrífuga. Sonicato durante 40 s a 20 kHz.
10. Proceda a la Western blot siguiendo los protocolos establecidos.

Tabla 1: Instrucciones para la preparación de soluciones clave

Recetas
Medios que contienen dispasa	1 mg/mL de dispasa + 10 μM de inhibidor de ROCK en DMEM F12 avanzado. Esterilizar con filtro de 0,22 μm.
Medios de disociación	10% FBS + 1x penicilina-estreptomicina en RPMI 1640. Esterilizar con filtro de 0,22 μm.
Tampón de lisis de proteínas	Tampón RIPA + inhibidores de la fosfatasa + inhibidores de la proteasa
Solución de bloqueo	10% FBS en PBS con 0.2% Triton X-100

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A83-01	Tocris	Año 2939
DMEM/F-12 avanzado	Thermo Fisher Scientific	12634010
Suplemento B-27 (50x), sin suero	Thermo Fisher Scientific	17504044
Dispasa II, Polvo	Thermo Fisher Scientific	17-105-041
Suero fetal bovino (FBS)	sigma	F8667
GlutaMAX Thermo	Fisher Científico	35050061
Inhibidor de la fosfatasa Halt	Thermo Fisher Scientific	78428
Matrigel GFR Matriz de membrana	Corning CB-	40230C
N-acetil-L-cisteína	sigma	A9165
Normocina	Thermo Fisher Scientific	ant-nr-1
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/ mL)	Thermo Fisher Scientific	15-140-122
Metacrilato de poli(2-hidroxietilo) (Poli-HEMA)	sigma	P3932-25G
Ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	PI89901
EGF humano recombinante, AnimalFree	PeproTech	AF-100-15
Noggin Humano Recombinante	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Medio, HEPES (cs de 10)	Thermo Fisher Scientific	22400105
Desmembrador sónico	Thermo Fisher Scientific	FB120
Tritón X-100	sigma	X100-5ML
Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK)	Selleck Químico	S1049-50MG