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>1. Fijación y tinción de organoides prostáticos para análisis inmunohistoquímicos mediante microscopía confocal de montaje completo
- Recolección de organoides prostáticos de placas de 24 pocillos — TIEMPO: 45-60 min
NOTA: Al recolectar organoides de próstata para procesarlos para la microscopía confocal, es fundamental manipularlos con cuidado para mantener su estructura. El protocolo de recolección a continuación está diseñado para reducir la interrupción de la estructura del organoide durante el aislamiento.
- Retire el medio de cada pocillo de la placa que contiene organoides inclinando la placa en un ángulo de 45°.
- Digiera el gel de la matriz incubándolo con 500 μL de medio que contenga dispasa (Tabla 1) durante 30 min en una incubadora de 5% CO2 a 37 °C.
- Recoja la suspensión de organoide digerida en un tubo de microcentrífuga y granule los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT. Retire el sobrenadante.
- Tinción inmunofluorescente de montaje completo de organoides de próstata — TIEMPO: 3-4 días (1-5 h/día)
- Añadir 500 μL de paraformaldehído al 4% en PBS e incubar durante 2 h a RT con una suave agitación.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min en RT, retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de PBS durante 15 min agitando suavemente.
- Lave el pellet como en el paso 1.2.2 dos veces más.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir 1 μg/mL de DAPI en la solución de bloqueo (Tabla 1). Incubar durante 2 h a RT o, alternativamente, durante la noche a 4 °C con una agitación suave.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir anticuerpo primario (anti-p63 de conejo, anticitoqueratina 8 de ratón) en la solución bloqueante e incubar durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de PBS durante 15 min agitando suavemente.
- Lave el pellet como en el paso 1.2.6 dos veces más.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir anticuerpo secundario (IgG-Alexa Fluor 594 anti-conejo de cabra, IgG anti-ratón de cabra Fluor 488) en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min en RT, retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de PBS durante 15 min agitando suavemente.
- Lave el pellet como en el paso 1.2.9 dos veces más.
>2. Limpieza de tejido y montaje de los organoides prostáticos teñidos para microscopía confocal de montaje completo — TIEMPO: 7 h
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 1 mL de sacarosa al 30% en PBS con Triton X-100 al 1% e incubar durante 2 h a RT con agitación suave.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 1 mL de sacarosa al 45% en PBS con Triton X-100 al 1% e incubar durante 2 h a RT con una suave agitación.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 1 mL de sacarosa al 60% en PBS con Triton X-100 al 1% e incubar durante 2 h a RT con una suave agitación.
- Granular los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el 95% del sobrenadante.
NOTA: El pellet se afloja a medida que aumenta la concentración de sacarosa. Se recomienda observar los organoides teñidos con DAPI bajo la luz ultravioleta para confirmar que no se perdieron durante la eliminación del sobrenadante.
- Transfiera una gota de 10-20 μL de la suspensión restante a un cubreobjetos con cámara y proceda a la microscopía confocal.
NOTA: Los fragmentos de cubreobjetos se pueden colocar a ambos lados de la gota para usarlos como espaciadores (Figura 1C). Estos evitan que los organoides colapsen cuando se coloca un cubreobjetos sobre la gota.
Tabla 1: Instrucciones para la preparación de soluciones clave
por
| componente | concentración |
| B-27 | 1x (diluido a partir de 50x concentrado) |
| GlutaMAX | 1x (diluido a partir de 100x concentrado) |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM |
| Normocina | 50 μg/mL |
| EGF humano recombinante, sin animales | 50 ng/mL |
| Noggin Humano Recombinante | 100 ng/mL |
| Medios condicionados con R-espondina 1 | 10% de medios acondicionados |
| A83-01 | 200 nM |
| DHT (Traducción asistida | 1 nM |
| Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avanzado | Medios de base |
| R-espondina 1 se genera como se describe en Drost, et al. Después de la adición de todos los componentes, el filtro esteriliza los medios organoides de ratón con un filtro de 0,22 μm. El inhibidor de ROCK solo se agrega durante el establecimiento del cultivo y el paso de organoides. |
