Aislamiento funcionalizado de células diana basadas en alambres: una técnica ex vivo para aislar células cancerosas de sangre periférica enriquecida

NOTA: Este protocolo describe el aislamiento de células HT-29 (línea celular de cáncer de colon humano) a partir de PBS o de mezclas artificiales de células HT-29 y sangre periférica. El mismo experimento se realizó con dos líneas celulares adicionales (LNCaP y VCaP) y teóricamente se puede realizar con todas las células que expresan EpCAM.

1. Preparación de las células objetivo

1. Cultivo celular y marcaje de células
   nota: En este protocolo, las células se cultivan en matraces de 75 cm². Ajuste las cantidades de reactivos en consecuencia si se utilizan otros dispositivos de cultivo celular (por ejemplo, placas de cultivo de 25 cm², placas de 6 pocillos, etc.). Todos los líquidos utilizados se precalientan a 37 °C en un baño de agua. Si no se indica lo contrario, todos los pasos del protocolo se realizan a temperatura ambiente (RT).
   1. Cultivo de células HT-29 en el medio modificado 5a de McCoy suplementado con 2 mM de L-glutamina, 20 mM de Hepes, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂.
   2. Cuando las células estén confluentes en un 90%, retire el medio y enjuague las células con 10 ml de 1x PBS.
   3. Para recolectar células, agregue 2 mL de la solución de desprendimiento de células (Tabla de Materiales y Reactivos) a las células e incube las células durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C.
      nota: La solución de desprendimiento contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas en 1x PBS, 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 3 mg/L de rojo fenol. Reduzca al mínimo el tiempo de precalentamiento de la solución de desprendimiento de células, ya que estará inactiva después de 1 h a 37 °C. Cubra toda la capa de células para obtener un desprendimiento óptimo de células.
   4. Compruebe el desprendimiento de células con un microscopio invertido.
   5. Transfiera todas las células desprendidas a un tubo de 50 mL prellenado con 10 mL de medio de cultivo celular (el mismo que se utilizó en el paso 1.1.1.) y vuelva a suspender las células mediante pipeteo.
   6. Coloque la suspensión de celda restante en un mezclador de rodillos horizontal en RT y continúe con el paso de etiquetado.
2. Etiquetado de células vivas de células objetivo
   1. Diluir 1 μL de 5 mM de CFSE (suministrado en dimetilsulfóxido, DMSO) en 1 mL de 1x PBS precalentado a 37 °C para obtener la solución de etiquetado de CFSE lista para usar de 5 μM.
      nota: Para obtener resultados óptimos de tinción, utilice soluciones recién preparadas.
   2. Prepare una solución de tinción de ADN lista para usar (Tabla de Materiales y Reactivos) en 1x PBS y guárdela a 2-6 °C protegida de la luz.
      nota: Para obtener resultados óptimos de tinción, utilice soluciones recién preparadas.
   3. Tome las células del mezclador de rodillos horizontales (paso 1.1.6.) y granule las células a 300 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mL de 1x PBS.
   4. Enjuague las células de nuevo con 1x PBS y vuelva a suspender el pellet de células en una solución de etiquetado CFSE lista para usar de 500 μL.
   5. Incubar las células a 37 °C durante 15 min y recoger las células después de la centrifugación a 300 x g durante 3 min.
   6. Vuelva a suspender las células marcadas en 1 ml de medio de cultivo celular precalentado y deje que las células se regeneren a 37 °C durante 30 minutos.
   7. Recoja las células por centrifugación a 300 x g durante 3 min y vuelva a suspender los gránulos celulares en 1 mL de solución de tinción de ADN lista para usar a 37 °C durante 10 min.
   8. Granule las células, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 4 ml de 1x PBS. Evalúe la densidad celular con un hemocitómetro y verifique el marcaje de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia equipado con filtros 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 1A y 1E).
   9. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 minutos y volver a suspender el pellet de células de acuerdo con las densidades de células necesarias para el experimento respectivo como se indica en la siguiente sección y colocar en hielo.

>2. Cargando el cable

NOTA: Las células se pueden aislar de los picos de células objetivo/sangre periférica en la escala de mililitros o proporcionando un número bajo de células en una escala de microlitros. Mientras que el primer enfoque permite imitar las condiciones de células raras en la sangre periférica, el segundo puede ser la forma preferida de unir algunas células con el fin de optimizar el protocolo/realizar pruebas.

1. Carga del cable utilizando un gran volumen de suspensiones de celdas
   1. Prepare una solución de bloqueo de BSA al 2% disolviendo 0,8 g de BSA en 40 ml de 1x PBS (uso de cultivo celular). Disuelva BSA por vórtice inicial y posterior incubación en RT en un mezclador de rodillos horizontales durante 10-20 min.
   2. Enjuague los tubos vacíos de EDTA/heparina sódica con 2 mL de BSA al 2% para eliminar los residuos de anticoagulante y desechar la solución. Bloquee la superficie del tubo mediante incubación a RT con 5 mL de BSA al 2% en un mezclador de rodillos horizontal a 15 rpm durante 30 min y deseche la solución.
   3. Diluya las células marcadas (sección 1.2.) hasta una densidad de 100.000 células/mL y utilice 5 mL para cargar el cable.
   4. Agregue 5 mL de la suspensión celular marcada (500,000 células en total) al tubo. Evite las burbujas al agregar la suspensión de celdas.
   5. Retire el cable del compartimiento de almacenamiento, así como la tapa de goma que sujeta el cable y enjuáguelo con 1x PBS (Figura 2).
   6. Penetre en el tapón del tubo de goma del tubo de EDTA (paso 2.1.4.) con la ayuda de una aguja de jeringa (20 G) e inserte el alambre de manera que la parte funcional quede completamente sumergida en la suspensión de la celda cuando el tapón vuelva a estar en el tubo y el tubo se coloque en el mezclador de rodillos inclinados.
      nota: La parte funcional de triple hélice del cable debe cubrirse con suspensión de celda durante toda la carga.
   7. Gire los tubos en un mezclador de rodillos inclinados a 5 rpm durante 30 minutos para permitir que las celdas se conecten al cable.
   8. Enjuague el cable con 5 mL 1x PBS y guárdelo en la oscuridad a 2-6 °C en un tubo de 15 mL que contenga 1x PBS hasta el examen visual.
      nota: La parte funcional del cable siempre debe estar sumergida en PBS para evitar dañar las celdas.
2. Aislar las células diana de mezclas artificiales con sangre periférica (método de carga alternativo a: 2.1. Carga del cable utilizando un gran volumen de suspensiones de celdas)
   1. Diluir las células marcadas (sección 1.2.) para obtener suspensiones celulares con alta densidad celular (> 1.000.000 de células/mL), manteniendo así bajo el volumen de suspensión celular añadido a la sangre periférica.
   2. Agregue de 500 a 500.000 células a 5 mL de sangre periférica y mézclelas invirtiendo el tubo.
   3. Retire el cable del compartimiento de almacenamiento, retire la tapa de goma que sujeta el cable y enjuáguelo con 1x PBS.
   4. Penetre un tapón de tubo nuevo con la parte no funcional del dispositivo con una aguja de jeringa (20 G) de modo que la parte funcional esté completamente sumergida en la sangre enriquecida cuando el tapón vuelva a estar en el tubo y el tubo se coloque en el mezclador de rodillos inclinado.
      nota: La parte funcional de triple hélice del cable debe cubrirse con suspensión de celda durante toda la carga.
   5. Incubar el tubo en el mezclador de rodillos inclinados a 5 rpm durante 30 min en RT.
   6. Enjuague el cable tres veces en 1x PBS y guárdelo en la oscuridad en un tubo de 15 mL que contenga 1x PBS hasta el examen visual.
      nota: La parte funcional del cable siempre debe estar sumergida para evitar dañar las células.
3. Carga del cable desde suspensiones de celdas de bajo volumen (método de carga alternativo a: 2.1. Carga del cable utilizando un gran volumen de suspensiones de celdas)
   1. Resuspender las células marcadas a 1.000.000 de células/mL en 1x PBS.
   2. Fije una pipeta Pasteur de vidrio desechable de 150 mm horizontalmente sobre una rejilla.
   3. Retire el cable del compartimiento de almacenamiento, pero mantenga la tapa de goma amarilla que sujeta el cable.
   4. Coloque el alambre en la pipeta de manera que la parte funcionalizada quede situada en la punta de la pipeta Pasteur sin tocar el vidrio.
      nota: La punta del alambre no debe sobresalir de la punta de la pipeta Pasteur. Evite tapar el extremo trasero de la punta de la pipeta Pasteur con la tapa de goma que sujeta el cable. Si se fijan firmemente, las suspensiones de celdas no se pueden cargar desde el otro lado en la punta de la pipeta.
   5. Cargue 15 μL de la suspensión celular en la punta de la pipeta Pasteur que cubre la parte funcionalizada del alambre.
   6. Incubar el alambre durante 10 min. Girar manualmente un cuarto de mano el alambre/punta de pipeta Pasteur ensamblado cada minuto.
   7. Retire el alambre de la punta de la pipeta Pasteur, enjuáguelo con 5 mL de 1x PBS y guárdelo en la oscuridad a 2-6 °C en un tubo de 15 mL que contenga 1x PBS hasta el examen visual.
      nota: La parte funcional siempre debe estar sumergida en 1x PBS para evitar dañar las células.

>3. Contar celdas en el alambre

>NOTA: Mantenga siempre la parte funcional del cable sumergida en 1x PBS para evitar dañar las células.

1. Use un bolígrafo de grasa para dibujar un área rectangular en un portaobjetos de vidrio y agregue 500 μL de 1x PBS.
2. Doble la parte no funcional del cable y colóquela en el portaobjetos de vidrio de modo que la parte funcional quede sumergida en 1x PBS.
   nota: Ajuste el área del rectángulo y el volumen de 1x PBS para cubrir completamente la parte funcional del cable. Utilice una cinta adhesiva de doble cara para montar la parte no funcional del cable en la corredera.
3. Inspeccione visualmente ambos lados del cable para enumerar las celdas capturadas (Figura 1B y 1F).
   nota: La presencia de células se determina utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros para DAPI y FITC. Se pueden inspeccionar ambos lados del cable y evaluar el número de celdas (para números de celdas altos) o contar (solo es factible si se conecta un número bajo de celdas al cable). Este paso se puede omitir si la enumeración de celdas no es necesaria.
4. Después de escanear, vuelva a colocar el cable en el tubo de 15 ml que contiene el 1x PBS, guarde el cable en la oscuridad.
   nota: La mayor parte de la parte no funcional del alambre se puede cortar (incluida la curva) y eliminar, lo que facilita el almacenamiento.

4. Desprendimiento y recuperación de células diana

NOTA: El desprendimiento de las células se realizará dentro de las 4 horas posteriores al aislamiento.

1. Disolver 4 mg del componente tampón de liberación (Tabla de Materiales y Reactivos) por mL de 1x PBS y filtrar la solución a través de un filtro estéril de 0,2 μm para obtener el tampón listo para usar.
   nota: El polímero del alambre está compuesto por un hidrogel que se funcionaliza con anticuerpos anti-EpCAM que permiten la unión a las células diana que presentan EpCAM. El tampón de liberación contiene una enzima proteolítica de carbono-oxígeno capaz de escindir el hidrogel. La escisión proteolítica da lugar a la degradación del polímero y, por tanto, al desprendimiento de las células capturadas.
2. Precalentar el tampón de liberación a 37 °C durante 5 min.
3. Agregue 1,6 mL de tampón de liberación para llenar un tubo de reacción de 1,5 mL.
   nota: Los tubos diseñados para volúmenes de reacción de 1,5 mL permiten la aplicación de 1,6 mL, que es necesario para sumergir la parte funcional del alambre.
4. Incubar la parte funcional del alambre en el tampón de liberación a 37 °C (baño de agua) durante 20 min. Utilice el tapón de goma suministrado con el alambre en lugar del tapón del tubo para fijar el alambre en el tubo de 1,5 mL para evitar la contaminación durante la incubación en el baño de agua.
5. Transfiera el conjunto de alambre/tubo a un agitador a RT y 500 rpm durante 15 min.
   nota: El agitador tiene una órbita de 1,5 mm.
6. Coloque el conjunto de alambre/tubo en una centrífuga y gírelo a 300 x g durante 10 min.
7. Retire el alambre del tubo, cierre la tapa y vuelva a centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min.
   nota: El cable se puede almacenar en 1x PBS a 2-6 °C en la oscuridad para el recuento de células para evaluar la eficiencia del desprendimiento/verificar las células que quedan en el cable.
8. Para reducir el volumen de la suspensión celular, elimine todo el sobrenadante excepto 100 μL (micromanipulación) o, alternativamente, 300 μL (citocentrifugación y posterior microdisección láser) y proceda inmediatamente a la toma de muestras unicelulares.

Figura 1: Visualización de celdas etiquetadas.(A,E) Celdas antes de cargar: Las celdas se marcan con CFSE y se contratiñen con un tinte intercalante de ADN que muestra un rango de intensidad de señal CFSE (verde). (B,F) Células marcadas capturadas en el cable. (C,G) Alambre después del procedimiento de desprendimiento de celdas. (D,H) Células desprendidas del alambre y recuperadas por citocentrifugación en un portaobjetos. CFSE: Canal FITC (verde). Tinción de ADN: canal DAPI (azul).

Figura 2: Figura 2: Cable y compartimento de almacenamiento.(A) Compartimentos del alambre. (B) Detalle de la pieza funcionalizada.