Muestreo de células individuales mediante micromanipulación: una técnica para aislar células individuales de la suspensión de células cancerosas

Resumen

Fuente: Chen S. et al. Enrichment de células objetivo y amplificación del genoma completo para la caracterización de células individuales aguas abajo. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe la técnica para aislar células individuales de un grupo de células objetivo para llevar a cabo análisis posteriores. En este método, se utiliza un micromanipulador instalado en un microscopio para el aislamiento de alta precisión de una sola célula objetivo.

Protocolo

1. Muestreo de una sola célula

1. Micromanipulación
   NOTA: Para permitir aplicaciones posteriores como el análisis del genoma completo (WGA), se agregarán células individuales aisladas a 2 μL de mezcla maestra de lisis celular. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con el número de celdas a procesar. Calcule los volúmenes adicionales de pérdida debido al pipeteo y coloque la mezcla maestra de lisis celular en hielo.
   1. Preparar la mezcla maestra de lisis celular (componentes del kit WGA, Tabla de Materiales y Reactivos). Brevemente, mezcle 2,0 μL de tampón de reacción, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solución al 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutilo) fenil-polietilenglicol (solución al 10%), 2,6 μL de una solución de proteinasa K y 12,8 μL de agua libre de RNasa/DNasa para obtener una mezcla maestra para 10 muestras (volumen total 20 μL).
      nota: Para obtener más muestras, aumente los volúmenes en consecuencia.      
   2. Use un bolígrafo de grasa para dibujar un área que mantenga la suspensión de la celda en su lugar. Ajuste el área y el volumen si la densidad de la celda es demasiado alta (es decir, marque un área más grande en el portaobjetos de vidrio, cargue 1x PBS y una alícuota de la suspensión de la celda).
   3. Pipetee toda la suspensión de la célula objetivo en el portaobjetos de vidrio.
   4. Transfiera el portaobjetos de vidrio a un microscopio equipado con un micromanipulador. Deje que las células se asienten durante 5 minutos.
   5. Prepare tubos de PCR de 0,2 mL cargados con 2,0 μL de mezcla maestra de lisis celular (preparada en el paso 1.1.1.) y guárdela en hielo.
   6. Recoja células individuales en 1 μL de 1x PBS usando el micromanipulador y transfiera las células a un tubo que contiene la mezcla maestra de lisis celular.
      nota: Para transferir células micromanipuladas al tampón de lisis celular, coloque el capilar directamente en los 2 μL de solución de lisis y expulse hasta que se puedan ver burbujas.
   7. Gire brevemente la muestra a 2000 x g durante 3 s usando un microfugo de escritorio para recoger todo el líquido en el fondo del tubo. Coloque las muestras en hielo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Tubos Vacutainer EDTA (o Na-heparina)	Bd	366450 (o 366480)	Se utiliza como tubo de reacción para la captura ex vivo de células diana
Pipetas Pasteur 150 mm	Volac	D810	Se utiliza para la aplicación de bajo volumen de células al C&R
Bolígrafo de grasa	Dako	S2002	Se utiliza en portaobjetos de vidrio para mantener la suspensión de la celda en su lugar
Axiovert M200 equipado con Mikromanipulator MMJ y CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Usa la micromanipulación a mano
Microcapilares (25 μm de diámetro), CustomTip Tipo I	Eppendorf	930001201	Se utiliza para la micromanipulación de células
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	710920