Muestreo de células individuales mediante microdisección por captura láser: una técnica para recolectar células objetivo de una población celular heterogénea

1. Muestreo de una sola célula

1. Microdisección láser
   NOTA: Se agregarán células individuales a 4,5 μL de mezcla maestra de lisis celular (componentes del kit WGA, Tabla de Materiales y Reactivos) para WGA.
   1. Prepare la mezcla maestra de lisis celular de acuerdo con Czyż et al. mezclando 5,0 μL de tampón de reacción, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solución al 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol (solución al 10%), respectivamente, 2,6 μL de una solución de proteinasa K y 34,8 μL de agua sin RNasa/DNasa para obtener una mezcla maestra para 10 muestras (volumen total 45 μL). Coloque la mezcla maestra en hielo.
      nota: Para obtener más muestras, aumente los volúmenes en consecuencia.
   2. Tratamiento UV de los portaobjetos recubiertos de membrana adecuados para la microdisección láser. Coloque los portaobjetos en un dispositivo de reticulación de ADN y expóngalos a los rayos UV más altos durante unos 10 minutos.
   3. Ensamble el portaobjetos recubierto de membrana en una citocentrífuga y centrifuga toda la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
      nota: Cuando se utiliza un sistema en líquido, donde las células se citocentrífugan en el portaobjetos en solución, retire el sobrenadante después de la citocentrifugación y aplique un centrifugado seco a 1140 x g durante 1 min.
   4. Proceda directamente a la microdisección láser o deje que los citospins se sequen al aire durante la noche y congele las muestras a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
   5. Pipetear 4,5 μL de mezcla maestra de lisis celular en la tapa de un tubo de PCR de 0,2 mL y recolectar células individuales mediante microdisección láser.
   6. Recupere el tubo de PCR del microscopio de microdisección láser y cierre el tubo. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un giro corto y coloque la muestra en hielo.
   7. Proceda con el WGA de una sola celda o almacene las muestras aisladas a -80 °C durante un máximo de 1 mes antes de continuar con el procesamiento.