Muestreo de células individuales mediante microdisección por captura láser: una técnica para recolectar células objetivo de una población celular heterogénea

Resumen

Fuente: Chen S. et al. Enrichment de células objetivo y amplificación del genoma completo para la caracterización de células individuales aguas abajo. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe la técnica para obtener una sola célula a partir de una población celular heterogénea utilizando microdisección de captura láser. La célula aislada se puede utilizar para estudios genómicos adicionales o investigaciones sobre el cáncer.

Protocolo

1. Muestreo de una sola célula

1. Microdisección láser
   NOTA: Se agregarán células individuales a 4,5 μL de mezcla maestra de lisis celular (componentes del kit WGA, Tabla de Materiales y Reactivos) para WGA.
   1. Prepare la mezcla maestra de lisis celular de acuerdo con Czyż et al. mezclando 5,0 μL de tampón de reacción, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solución al 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol (solución al 10%), respectivamente, 2,6 μL de una solución de proteinasa K y 34,8 μL de agua sin RNasa/DNasa para obtener una mezcla maestra para 10 muestras (volumen total 45 μL). Coloque la mezcla maestra en hielo.
      nota: Para obtener más muestras, aumente los volúmenes en consecuencia.
   2. Tratamiento UV de los portaobjetos recubiertos de membrana adecuados para la microdisección láser. Coloque los portaobjetos en un dispositivo de reticulación de ADN y expóngalos a los rayos UV más altos durante unos 10 minutos.
   3. Ensamble el portaobjetos recubierto de membrana en una citocentrífuga y centrifuga toda la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
      nota: Cuando se utiliza un sistema en líquido, donde las células se citocentrífugan en el portaobjetos en solución, retire el sobrenadante después de la citocentrifugación y aplique un centrifugado seco a 1140 x g durante 1 min.
   4. Proceda directamente a la microdisección láser o deje que los citospins se sequen al aire durante la noche y congele las muestras a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
   5. Pipetear 4,5 μL de mezcla maestra de lisis celular en la tapa de un tubo de PCR de 0,2 mL y recolectar células individuales mediante microdisección láser.
   6. Recupere el tubo de PCR del microscopio de microdisección láser y cierre el tubo. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un giro corto y coloque la muestra en hielo.
   7. Proceda con el WGA de una sola celda o almacene las muestras aisladas a -80 °C durante un máximo de 1 mes antes de continuar con el procesamiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
McCoy's 5A Medium (1x) supl. con L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	16600-082	Medio de cultivo utilizado para las células HT-29, adapte el medio de cultivo a la línea celular utilizada para los experimentos
Solución tampón HEPES (1 m)	PAA	S11-001	Suplemento para McCoy's 5A Medio
Suero Fetal Bovino Oro	PAA	A15-151	Suplemento para el medio modificado 5a de McCoy
Penicilina-estreptomicina (100x)	Biooeste	L0018-100	Suplemento para el medio modificado 5a de McCoy
Solución salina tamponada con fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Accutase	Biooeste	L0950-100	Solución de desprendimiento celular (cultivo celular)
Baño de agua	GFL (en inglés)	Tipo 1003	Se utiliza para soluciones de precalentamiento
incubadora	Thermo Fisher Scientific		Se utiliza para incubar células (cultivo celular)
Tubos de reacción de 50 mL	VWR	525-0403
Mezclador de rodillos	Stuart Científico	SRT6D	Se utiliza para unir las células al alambre mientras se evita que las células se sedimenten
Kit de proliferación celular CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientific	C34554	Se utiliza para etiquetar células vivas (etiqueta citoplasmática)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Scientific	Se utiliza para teñir el ADN (contratinción nucleica)
Centrífuga (equipada para contener tubos de reacción de 15 mL y 50 mL)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Se utiliza para peletizar celdas
Observer Z1 (Microscopio de fluorescencia/microdisección láser)	Carl Zeiss Microimagen		Microscopio invertido (inmunofluorescencia) capaz de microdisección láser; Los microscopios de fluorescencia deben ser capaces de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) y CFSE (filtro FITC)
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Se utiliza para recubrir superficies de vidrio/plástico
MS1 Miniagitador	Sigma-Aldrich	Z404039	Se utiliza para el vórtice
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Cable funcionalizado capaz de aislar y separar células EpCAMpositivas (también conocidas como catch&release, C&R)
Agujas de jeringa (G20)	VWR	613-0554	Se utiliza para perforar tapas de goma con el fin de permitir que la parte no funcional del C&R pase a través de ellas
Cámara de Neubauer	Roth	T729.1	Se utiliza para contar células
Pipetas Pasteur 150 mm	Volac	D810	Se utiliza para la aplicación de bajo volumen de células al C&R
Bolígrafo de grasa	Dako	S2002	Se utiliza en portaobjetos de vidrio para mantener la suspensión de la celda en su lugar
Agitador de placas Delfia	Perkin Elmer	1296-003	Se utiliza para la agitación durante el desprendimiento de la célula
Tubos de 1,5 ml	Eppendorf	30.125.150
Kit Ampli1 WGA	Biosistemas de silicio		A pedir a través de Silicon Biosystems
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	710920
Citocentrífuga y equipo	Hettich	Universal 32	Utilice la citocentrífuga a mano
Termociclador	Bio-Rad	Díada del motor de ADN	Se pueden utilizar todos los termocicladores con tapa calefactada
Microcentrífuga	Roth	CX73.1	Utilice una centrífuga de sobremesa a mano
Stratalinker UV 1800	Estratogén	400072	Utilice el reticulante de ADN a mano

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