Inyección intraprostática de células cancerosas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación preoperatoria del ratón

NOTA: Aloje a los ratones en el animalario de la universidad durante al menos una semana antes de la cirugía para permitir una adaptación adecuada y minimizar el estrés animal. Los pasos 1.1-1.6 son realizados por el asistente del cirujano. Todos los pasos quirúrgicos posteriores son realizados por el cirujano utilizando guantes estériles y herramientas quirúrgicas con técnica estéril.

1. Anestesiar a los ratones con isoflurano (2-5% para la inducción a través de la cámara, 1-3% para el mantenimiento a través del cono nasal). Verifica la inducción completa por la pérdida del reflejo de pinzamiento del dedo del pie.
2. Pesar los ratones y administrar al menos 0,05 mg/kg del analgésico buprenorfina s.c.
   nota: El peso del ratón ≥20 g es ideal para el éxito de las inyecciones intraprostáticas.
3. Aplique lubricante con ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad de la córnea.
4. Afeita todo el pelaje del abdomen.
5. Esterilice el abdomen mediante tres rondas de aplicación circular de exfoliante quirúrgico con almohadillas estériles no adherentes seguidas de toallitas estériles con alcohol. Deje que el abdomen se seque.
   nota: Para el resto del procedimiento quirúrgico, solo se deben usar guantes estériles e instrumentos quirúrgicos para entrar en contacto con el abdomen del ratón esterilizado.
6. Transfiera el ratón en decúbito supino sobre una superficie limpia sobre una almohadilla térmica directamente debajo del objetivo de un microscopio quirúrgico limpio.
7. Cubra el ratón con un paño estéril con un pequeño agujero sobre el abdomen.

2. Inyección intraprostática

NOTA: Realice todos los pasos quirúrgicos en condiciones estériles. El ajuste del microscopio, la colocación del ratón o cualquier otro objeto no estéril debe realizarse con ayuda adicional.

1. Realizar una incisión de aproximadamente 1 cm de la piel externa a lo largo de la línea media del abdomen superior al pene y a las glándulas prepuciales (Figura 1D).
2. Separe el tejido conectivo entre la piel abdominal externa y la musculatura abdominal interna abriendo las tijeras entre las capas.
3. Realice una incisión similar en los músculos abdominales internos, utilizando fórceps para elevar los músculos y evitar perforar los intestinos o la vejiga (Figura 1D).
4. Localice una de las vesículas seminales bilaterales (Figura 1A, blanco)/lóbulos anteriores de la próstata (Figura 1A, negro), que a menudo son posteriores, laterales y ligeramente superiores a la vejiga (Figura 1A, amarillo), pero esto puede variar entre ratones. Los lóbulos anteriores de la próstata son translúcidos y están unidos a la curvatura menor de las vesículas seminales blancas.
5. Levante suavemente la punta de la vesícula seminal con las pinzas de tejido de Graefe para crear tensión en el tejido sin perforar la vesícula seminal (Figura 1E).
6. Mezcle la solución de matrigel Myc-CaP mediante pipeteo gentil (realizado por el cirujano asistente), ya que las células pueden haberse granulado, y aspire lentamente 30 μL (1x10⁶ células) en la aguja para evitar burbujas de aire.
7. Inserte con cuidado el bisel de la aguja paralelo al eje largo del lóbulo anterior de la próstata. Inyecte lentamente 30 μL en el lóbulo y luego retraiga lentamente la aguja para evitar fugas (Figura 1F). Verificar una inyección adecuada por ingurgitación del lóbulo prostático anterior (Figura 1G).
8. Sostenga con cuidado la vesícula seminal y el lóbulo prostático fuera del ratón durante aproximadamente 30 s para permitir que la matriz se solidifique parcialmente dentro del lóbulo. Durante este tiempo, recoja cualquier fuga de solución celular en el abdomen con un aplicador estéril con punta de poliéster para prevenir el desarrollo de tumores no ortotópicos sin presionar el lóbulo prostático inyectado.
9. Regrese con cuidado la vesícula seminal y el lóbulo prostático inyectado al abdomen sin ejercer presión sobre el lóbulo. Reemplace los tejidos externalizados.
10. Realice suturas continuas para cerrar los músculos abdominales internos con suturas de aguja de corte inverso absorbibles 5-0 vicryl.
11. Realice suturas interrumpidas para cerrar la piel abdominal externa con suturas de aguja de corte inverso no absorbibles de monofilamento de nailon 4-0. nota: Las grapas esterilizadas de 9 mm también se pueden utilizar para cerrar la piel abdominal externa. Sin embargo, a diferencia de las suturas, interfieren con cualquier señal de imagen tumoral bioluminiscente y fluorescente posterior.
12. Limpie todas las herramientas con toallitas de etanol estériles (abiertas por el asistente del cirujano) y colóquelas en un esterilizador de perlas de vidrio durante 30 s. Deje que las herramientas se sequen antes de usarlas en el siguiente ratón.
13. Enjuague la jeringa y la aguja con solución salina estéril (abierta por el asistente del cirujano) para evitar la obstrucción por los restos de matrigel.
    nota: Un asistente de cirujano debe estar presente para todas las operaciones, realizando toda la preparación preoperatoria no estéril del ratón y el cuidado postoperatorio del ratón, así como mezclando la solución de matrigel Myc-CaP antes de las inyecciones. Para minimizar el tiempo, ya que cada procedimiento intraprostático con ratón requerirá de 20 a 30 minutos, el asistente del cirujano puede comenzar a preparar el siguiente ratón mientras el cirujano sutura el ratón actual.

>3. Cuidado postoperatorio del ratón

1. Administrar 1 mg/kg del analgésico meloxicam s.c. inmediatamente, 24 h y 48 h después de la cirugía.
2. Permita que los ratones se recuperen en una jaula sin ropa de cama colocada a mitad de camino sobre una almohadilla térmica. Monitoree a los ratones durante al menos 30 minutos después de la cirugía hasta que recuperen la movilidad y la actividad normales, después de lo cual colóquelos en una jaula limpia con comida en el piso de la jaula.
3. Además, controle a los ratones diariamente para la cicatrización adecuada de las heridas, el peso corporal, el aseo y la deambulación después de la cirugía. Separe a los ratones en jaulas individuales ante cualquier evidencia de pelea.
4. Retire las suturas restantes dentro de los 14 días posteriores a la cirugía.

Figura 1: Lóbulo prostático anterior, ganglios linfáticos drenantes y técnica representativa de inyecciones intraprostáticas de células. Imágenes de (A) lóbulo prostático anterior derecho (negro, *), vesícula seminal derecha adherida (blanco), testículo derecho y almohadilla de grasa (verde) y vejiga (amarillo), (B) ganglios linfáticos paraaórticos bilaterales de drenaje prostático (naranja), (C) tijeras de microdisección, pinzas de Graefe, pinzas de tejido de Graefe, un soporte de aguja con cortadores de sutura y una jeringa de 50 μL con aguja de calibre 28 (de izquierda a derecha), (D) incisiones en la línea media, (E) exteriorización de la vesícula seminal y del lóbulo prostático anterior, (F) inyección intraprostática y (G) congestión del lóbulo prostático anterior.