Generación de células de cáncer de próstata quimiorresistentes: un procedimiento para obtener células cancerosas resistentes a los medicamentos in vitro

En este artículo

Resumen

Fuente: Mohr, L. et al. Generación de modelos de células de cáncer de próstata de resistencia al agente antimitótico docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe un protocolo para generar modelos celulares de cáncer de próstata resistentes a taxanos. Estos modelos pueden ayudar a estudiar las vías implicadas en la progresión a la resistencia a Docetaxel en pacientes con cáncer de próstata.

Protocolo

1. Generación de células de cáncer de próstata resistentes al docetaxel

NOTA: Realice tratamientos celulares utilizando el stock de solución de Docetaxel utilizado para la determinación de la concentración del fármaco IC50 (prepare suficiente stock con antelación para el uso experimental). Las células parentales deben cultivarse en paralelo en un matraz pequeño durante todo el procedimiento y exponerse al vehículo (DMSO) en los volúmenes correspondientes que imiten las cantidades utilizadas en los matraces tratados con Docetaxel.

Placa de pilas DU145 o 22Rv1 en^{matraces de 150 cm, 2} que contengan 20 mL de medio (3,5 x 10,⁶ pilas por matraz para DU145 y 6,5 x 10,⁶ pilas por matraz para 22Rv1). Se recomienda el uso de 10 a 20 frascos de celdas para tener suficientes celdas al final del protocolo.
Después de 24 h, cuando las células están en aproximadamente un 70-80% de confluencia (Figura 1B, antes de Docetaxel), agregue Docetaxel a la concentración IC50 (5 nM para las células descritas en este protocolo).
Después de 72 h, aspire los medios que contengan fármaco y agregue medios nuevos sin Docetaxel (Figura 1B, 72 h después de Docetaxel). Cambie los medios cada 3-4 días. En aproximadamente 1-2 semanas, los clones resistentes aparecerán evidentes bajo el microscopio (Figura 1B, 7 y 14 días después de Docetaxel).
Aspire los medios, lave cuidadosamente las células con 15 mL de PBS e incube con 4 mL de tripsina-EDTA al 0,05% durante 3-5 min a 37 °C para separar las células de la superficie del matraz.
Vuelva a suspender las células tripsinizadas del matraz utilizando 8 mL de medio fresco. Pool cells de todos los matraces tratados. Celdas de pellets por centrifugación (300 x g, 3 min, RT).
Retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet de células en 20 mL de medio fresco y colocar las células en^{matraces de 150 cm2} (3,5 x 10⁶ células por matraz para DU145 y 6,5 x 10⁶ células por matraz para 22Rv1).
Después de 24 h, cuando las células estén en aproximadamente un 70-80% de confluencia, agregue 5 nM de Docetaxel (concentración inicial de IC50) nuevamente.
Repita los pasos 1.3 a 1.6 el día 3.
Después de 24 h, cuando las células estén en aproximadamente un 70-80% de confluencia, trátelas con una concentración de Docetaxel 2X IC50 (10 nM para las células descritas en este protocolo).
Repita los pasos 1.3 a 1.8, después de un aumento de la dosis de las concentraciones de docetaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM y 250 nM), para generar una población estable de células que crecen en los matraces bajo la concentración final más alta. Para concentraciones más altas, el protocolo de escalada de dosis puede implementarse hasta 6 meses hasta que se alcance la concentración de 1.000 nM (Figura 2A).

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Resultados

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Figura 1: Generación de sistemas modelo de células de cáncer de próstata resistentes a Docetaxel.(A) Diagrama que muestra la determinación del Docetaxel IC50 en las líneas celulares parentales de cáncer de próstata DU145 y 22Rv1 (Paso 1 del protocolo). Se incluyen los porcentajes esperados de viabilidad celular y las concentraciones necesarias de aumento de dosis de Docetaxel. Se inc...