1. Preparación de células para imágenes en vivo
- Cultive células CWR22Rv1 que expresen la cadena ligera 3 acoplada a proteínas fluorescentes verdes (LC3-GFP) en medios de cultivo RPMI que contengan un 10% de FBS y un 1% de antibióticos en placas de cultivo con fondo de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de 35 mm. Las células deben estar sembradas a una densidad suficiente para facilitar una proliferación rápida, pero no tanto como para que las células crezcan demasiado y se agrupen en el momento de la toma de imágenes.
- Tratar muestras celulares seleccionadas con IDA (0,3 μg/mL) en PBS.
- Aproximadamente 1 hora antes de la toma de imágenes, diluya 1,5 μl de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) con 20 ml de RPMI que contengan 10% de FBS y 1% de antibióticos. Utilice soluciones que contengan IDA para muestras seleccionadas. Calentar todos los medios a 37 °C antes de añadirlos a la placa de cultivo.
- Incubar las células con RPMI que contengan LysoTracker Red DND-99 durante 15-45 min a 37 °C.
- Aproximadamente 30 minutos antes de la toma de imágenes, encienda el recinto ambiental WeatherStation y permita que se equilibre a 37 °C y 5% deCO2 (con aire humidificado).
- Lave las células con PBS y reemplace los medios con RPMI estándar que contengan solo 10% de FBS y 1% de antibióticos. Agregue ADI a las muestras como se indica.
- Monte las placas de cultivo con fondo de cubreobjetos de 35 mm en un adaptador personalizado (Applied Precision, Inc., WA) y colóquelas en la platina del microscopio. Utilice aceite de inmersión (índice de refracción 1,520) en la lente del objetivo 60X 1,42 NA y coloque la antena de cultivo montada en el escenario.
2. Microscopía de iluminación estructurada (OMX) de superresolución
NOTA: El protocolo de esta sección se aplica al uso del Microscopio de Iluminación Estructurada OMX (Applied Precision, WA).
- Encienda la alimentación principal y los láseres deseados (410 nm, 488 nm y/o 532 nm). Espere 20 minutos para que los láseres se estabilicen térmicamente.
- Añada aceite de inmersión (índice de refracción 1,516 para muestras fijas en RT) en el objetivo 60X 1,42 NA. Si se ven burbujas en la gota de aceite, limpie el objetivo y vuelva a agregar aceite.
- Coloque el portaobjetos de muestra en la plataforma y, si es necesario, espere 10 minutos para que las células se asienten en el cubreobjetos.
- Inicialice el programa de adquisición. Utilice la iluminación de fluorescencia para ajustar el enfoque hasta que se pueda ver un contorno nítido de la célula.
nota: Se debe tener cuidado en todo momento para minimizar la exposición de las células a la excitación de fluorescencia, hasta la adquisición real de la imagen.
- Se puede adquirir un escaneo de mosaico en espiral para previsualizar áreas más grandes de la muestra para seleccionar celdas o regiones de interés. Se recomienda utilizar tiempos de exposición cortos (1-10 mseg) y baja potencia de excitación (0,1-1% de transmisión) mientras se escanea la muestra o se encuentran objetivos.
- Identificación de autofagosomas por fluorescencia GFP-LC3. Identifique los lisosomas mediante Alexa Fluor 555 anti-LAMP (proteína de membrana asociada a lisosomas) y los núcleos celulares mediante DAPI (muestras fijas).
- Elija condiciones experimentales que incluyan la longitud de onda de excitación, el área de la imagen (por ejemplo, 512x512), el grosor de la pila, el tiempo de exposición y el porcentaje de transmisión del láser. En el caso de las imágenes con resolución superprecisa, asegúrese de que la opción de iluminación estructurada esté activada. Para la microscopía de deconvolución en el OMX, seleccione la opción de iluminación convencional.
- Para obtener los mejores resultados de reconstrucción, seleccione condiciones experimentales tales que el recuento de intensidad máxima esté entre 10.000 y 15.000 durante la adquisición. Si el fotoblanqueo es una preocupación, se pueden usar imágenes con una exposición más baja (recuentos entre 5,000 y 10,000). Idealmente, los recuentos no deben disminuir más de un factor de dos durante toda la adquisición, y se deben evitar las disminuciones en más de un factor de cuatro. Si es necesario, reduzca el grosor de la pila para garantizar un recuento de intensidad sostenido. La cámara satura a 64.000 recuentos, por lo que la intensidad máxima nunca debe superar esto. Para buenas muestras, encontramos que las condiciones experimentales son un tiempo de exposición de 10 ~ 50 mseg con una transmisión láser del 1%. Se prefieren muestras brillantes y fotoestables que se puedan fotografiar repetidamente. Se requiere una tinción estable para las imágenes de lapso de tiempo y súper resueltas.
- Para reducir el ruido, se recomienda una velocidad de lectura de 95 MHz (opción de velocidad media) y un tiempo de adquisición de 2 mseg o más. Se obtienen artefactos aumentados en la imagen reconstruida cuando la muestra se mueve durante la adquisición. Debido a este efecto, se recomiendan exposiciones cortas para células no adherentes o de movimiento rápido.
- La adquisición de imágenes multicanal se puede realizar de forma simultánea o secuencial. El modo secuencial produce menos diafonía y, por lo tanto, se recomienda.
- Para reducir el fotoblanqueo, generalmente se recomienda obtener primero imágenes con longitudes de onda de excitación más largas (532 nm, 488 nm y luego 410 nm). Sin embargo, para los resultados experimentales que se muestran en la Figura 1, este orden se invirtió (es decir, 48 nm, 532 nm y 410 nm) debido a la fotoestabilidad de esta muestra en particular.
- Establezca el límite superior/inferior de la pila Z moviendo la platina del microscopio hasta que la parte superior/inferior de las células esté ligeramente desenfocada. La distancia deseada entre cada imagen debe mantenerse constante en 0,125 μm para obtener imágenes de súper resolución, ya que el software de reconstrucción toma este valor como predeterminado.
- Reconstrucción de pilas de imágenes con SoftWorX (Applied Precision, WA) y analícelas con VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
