Extracción de proteínas y proteólisis: un método para obtener proteínas de muestras de tejido tumoral de próstata y su digestión enzimática en péptidos

Resumen

Fuente: Cheng, L. C. et al. Enriquecimiento de fosfopéptidos junto con espectrometría de masas cuantitativa sin marcaje para investigar el fosfoproteoma en el cáncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe la técnica de extracción y digestión de proteínas para obtener péptidos del tejido tumoral de próstata. Estos péptidos, en análisis posteriores, pueden ayudar a identificar nuevos objetivos para la oncoterapia.

Protocolo

1. Extracción de proteínas

1. Preparar el tampón de lisis (Tabla 1). (El volumen depende del número de muestras que se vayan a recolectar).
2. Recolección de tejidos
   1. Pesar el tumor y agregar 2 ml de tampón de lisis helado por cada 100 mg de tejido en un tubo de ensayo de cultivo. (Por lo general, se necesitan de 50 a 150 mg de peso húmedo del tejido).
3. Homogeneizar el lisado con un homogeneizador manual o de sobremesa (pulso 2x durante 15 s). Limpie el homogeneizador antes de la primera muestra y entre muestras utilizando un 10 % de lejía, un 70 % de etanol y agua desionizada en sucesión.
4. Para reducir y alquilar, calentar las muestras homogeneizadas a 95 °C durante 5 min. Luego, déjalos enfriar sobre hielo durante 15 min. En hielo, sonique el lisado 3 veces (es decir, pulse durante 30 s con pausas de 60 s entre pulsos). La muestra no debe ser viscosa ni grumosa en este punto. Calentar el lisado a 95 °C durante 5 min.
5. Centrifugar el lisado en el mismo tubo de sonicación utilizando un rotor de cubo oscilante a 3.500 x g a 15 °C durante 15 min. Recoger el sobrenadante y desechar el pellet.
6. Determine la concentración de proteínas mediante la realización de un ensayo de Bradford. Si es necesario, diluir el lisado a 5 mg/mL con un tampón de lisis. Guárdelo a -20 °C.
   NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Congele las muestras a -80 °C y utilícelas para análisis posteriores.

>2. Digestión del lisado

1. Diluir la muestra 12 veces utilizando 100 mM de Tris (pH = 8,5) para reducir la cantidad de guanidinio. Diluya todas las muestras al mismo volumen para minimizar los efectos de una digestión desigual. Guarde 12,5 μg del lisado sin digerir para confirmarlo en un gel teñido de Coomassie.
2. Para obtener 5 mg de proteína, agregue 10 μg de Lysyl Endopeptidasa (Lys-C) e incube a temperatura ambiente durante 5-6 h. Ajuste el pH a 8.0 agregando 1 M de Tris sin ititar (pH ~ 11).
3. Prepare 1 mg/mL de tripsina tratada con L-1-tosilamido-2-feniletil clorometilcetona (TPCK) en 1 mM de HCl (con 20 mM de CaCl₂). Añadir la tripsina en una proporción de tripsina:proteína de 1:100 e incubar a 37 °C durante 3 h.
4. Agregue la misma cantidad de tripsina fresca que en el paso 2.3. Incubar a 37 °C durante la noche.
5. Guarde 12,5 μg del lisado digerido para confirmar la digestión completa en un gel teñido de Coomassie.

>3. Extracción en fase inversa

1. Registre el volumen del lisado. Filtre la muestra utilizando un filtro de corte de 15 mL y 10 kDa. Centrifugar la muestra a 3.500 x g utilizando el rotor de cubo oscilante (o 3.500 x g en un rotor de ángulo fijo) a 15 °C hasta que el volumen del retenido sea inferior a 250 μL (esto tarda aproximadamente 45-60 min). Recoja el flujo y deseche el retenido.

Tabla 1: Tampones y soluciones.Esta tabla muestra las composiciones de los búferes y las soluciones utilizadas en este protocolo.

búfer	volumen	composición
Tampón de lisis de cloruro de guanidinio 6 M	50 mL	6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sodio, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glucósido, agua ultrapura a volumen
100 mM de pirofosfato de sodio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sodio decahidratado, agua ultrapura a volumen
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, agua ultrapura a volumen
Ácido trifluoroacético al 5%	20 mL	Agregue 1 mL de ácido trifluoroacético 100% en 19 mL de agua ultrapura
Ácido trifluoroacético al 0,1%	250 mL	Agregue 5 ml de ácido trifluoroacético al 5% a 245 ml de agua ultrapura
tampón de elución pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Tampón de elución pST	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 50% de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Búfer de enlace IP	200 mL	50 mM tris pH 7.4, 50 mM cloruro de sodio, agua ultrapura a volumen
25 mM de bicarbonato de amonio, pH 7,5	10 mL	Disolver 19,7 mg en 10 ml de agua ultrapura estéril, pH a 7,5 con ácido clorhídrico 1 N (~10-15 μL/10 ml de solución), hacer fresco
Tampón de fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de dihidrógeno fosfato de sodio, 577 mL 1 M de hidrogenofosfato de sodio
Tampón de equilibrio	14 mL	6,3 ml de acetonitrilo, 280 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 1740 μL de ácido láctico, 5,68 ml de agua ultrapura
Tampón de enjuague	20 mL	9 mL de acetonitrilo, 400 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 10,6 mL de agua ultrapura
Solución de espectrometría de masas	10 mL	500 μL de acetonitrilo, 200 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 9,3 mL de agua ultrapura
Búfer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 5 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
Búfer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 350 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
Hidróxido de amonio al 0,9%	10 mL	300 μL 29,42% de hidróxido de amonio, 9,7 mL de agua ultrapura

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Congelador de temperatura ultrabaja	Panasonic	MDF-U76V
Congelador -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Cucharón de rotor oscilante	ThermoFisher Scientific	75004377
Rotador de extremo a extremo	ThermoFisher Scientific	415110Q
Tubos de Eppendorf de baja unión a proteínas	Eppendorf	22431081
Tripsina, tratada con TPCK	Worthington Biochemicals	LS003740
Lisil Endopeptidasa	Wako Industrias Químicas Puras, Ltd.	125-05061
Agua MilliQ			Agua desionizada utilizada para preparar todas las soluciones y tampones
Desmembrador sónico	Fisher Científico	FB-120	Sonicador
Sistema Polytron PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	Homogeneizador