Purificación de péptidos: una técnica basada en RP-HPLC para extraer péptidos de lisados de proteínas digeridas

Resumen

Fuente: Cheng, L. C. et al. Enriquecimiento de fosfopéptidos junto con espectrometría de masas cuantitativa sin marcadores para investigar el fosfoproteoma en el cáncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

En este vídeo, demostramos la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa para purificar péptidos de una mezcla de lisado de proteínas digeridas. A continuación, estos péptidos purificados se liofilizan y se almacenan para aplicaciones posteriores. El análisis de péptidos puede ayudar a comprender la mecánica involucrada en la señalización celular y el cáncer.

Protocolo

1. Extracción de fase inversa

1. Comience con un lisado de proteínas predigerido en un frasco de vidrio. Filtre la muestra utilizando un filtro de corte de 15 mL y 10 kDa. Centrifugar la muestra a 3.500 x g utilizando el rotor de cangilón oscilante (o 3.500 x g en un rotor de ángulo fijo) a 15 °C hasta que el volumen de retención sea inferior a 250 μL (esto tarda aproximadamente 45 - 60 min). Recoja el flujo y deseche el retenido.
   NOTE: El experimento se puede pausar aquí. Congele las muestras a -80 °C para su uso posterior.
2. Para acidificar la muestra, agregue aproximadamente 20 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 5% por mL de lisado. Mézclalos bien y mide el pH de la muestra utilizando tiras de pH. Ajuste el pH a 2.5 usando 5% de TFA.
3. Conecte el extremo más corto de una columna C-18 a un colector de vacío. Ajuste el vacío entre 17 y 34 kPa (o según las instrucciones del fabricante). Con pipetas de vidrio, humedezca la columna con 3 mL de acetonitrilo (ACN) al 100%. No deje que la columna se seque.
4. Utilizando pipetas de vidrio, equilibre la columna con 6 mL de TFA al 0,1% aplicados como 2x 3 mL. Cargue la muestra acidificada en la columna. No agregue más de 3 ml a la vez. Ajuste la aspiradora para apuntar alrededor de 1 a 2 gotas por segundo.
5. Con pipetas de vidrio, lavar la columna con 9 mL de TFA al 0,1% aplicados como 3x 3 mL. Eluir la columna con 2 mL de 40% ACN, 0,1% TFA. Recoja dos fracciones de 2 mL en tubos de cultivo de vidrio. Deseche la columna.
6. Cubra los tubos eluidos con parafilm y perfore de 3 a 5 agujeros en la cubierta con una aguja de 20 G. Congele el eluido en hielo seco durante al menos 30 minutos hasta que se solidifique por completo.
7. Liofilizar las fracciones durante la noche. Al día siguiente, asegúrese de que las muestras estén completamente secas antes de detener el liofilizador. Guarde los tubos en un tubo cónico de 50 ml con toallitas delicadas a -80 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Congelador de temperatura ultrabaja	Panasonic	MDF-U76V
Congelador -20 ° C	VWR	scpmf-2020
Cucharón de rotor oscilante	ThermoFisher Scientific	75004377
Colector de vacío	Restek	26080
Liofilizador	Labconco	7420020
CentriVap Concentrador de vacío de sobremesa	Labconco 7810010
Amicon Ultra-15 Unidades de filtro centrífugo	Millipore Sigma
Rotor de extremo a extremo	ThermoFisher Scientific	415110Q
Tubos de cultivo de vidrio	Fisher Scientific	14-961-26
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Aguja 20G	BD	B305175
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Tapón de rosca criotubo	ThermoFisher Scientific	379189
Nunc 15 mL tubos cónicos	ThermoFisher Scientific	12-565-268
Tubos Eppendorf de baja unión a proteínas	Eppendorf	22431081
jeringa de 3 mL	BD	309657
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Scientific	PI-28904
Acetonitrilo (ACN)	Agua Fisher Scientific	A21-1
MilliQ			Agua desionizada utilizada para preparar todas las soluciones y tampones

UFC901024