Enriquecimiento de fosfopéptidos: una técnica de inmunoprecipitación basada en anticuerpos para separar péptidos fosforilados específicos de mezclas de péptidos complejos

Resumen

Fuente: Cheng, L. C., et al. Enriquecimiento de fosfopéptidos junto con espectrometría de masas cuantitativa sin etiquetas para investigar el fosfoproteoma en el cáncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018).

En este video, demostramos la inmunoprecipitación de fosfopéptidos basada en anticuerpos a partir de una mezcla de péptidos. Los fosfopéptidos enriquecidos se concentran al vacío y se almacenan para su análisis posterior.

Protocolo

>1. Inmunoprecipitación y enriquecimiento de péptidos pY

1. Vuelva a suspender el polvo liofilizado de péptidos purificados con 0,5 mL de tampón de unión a inmunoprecipitación (IP) frío como hielo en cada fracción. Agrupe las fracciones transfiriendo el volumen de resuspensión de 0,5 ml de la segunda fracción a la primera fracción y guarde la punta de la pipeta. Vórtice vigorosamente (en lugar de pipetear hacia arriba y hacia abajo) para garantizar que la muestra se disuelva por completo antes de transferirla a un criotubo con tapón de rosca de 3,6 mL.
2. Enjuague los tubos de liofilización con otros 0,5 mL de tampón de unión IP (Tabla 1) en cada tubo. Transfiera la solución al tubo de rosca de 3,6 ml utilizando la misma punta de pipeta para minimizar la pérdida de muestra. Repita el enjuague 1 vez más, haciendo que el volumen final de resuspensión sea de 2 mL (para 5 mg de proteína). Mida el pH de la muestra para asegurarse de que sea de aproximadamente 7,4. Si es demasiado ácido, agregue iterativamente 10 μL de Tris 1M (sin estimular, pH ~ 11). Si es demasiado básico, agregue iterativamente 10 μL de HCl diluido (1:25 o 1:100).
3. Lavar previamente las perlas de pY (para 5 mg de lisado inicial)
   1. Se necesitan 25 μg de anticuerpo 4G10 y 12,5 μg de anticuerpo 27B10.4 por muestra. Después de utilizar una pipeta p200 con una punta cortada para transferir los anticuerpos a tubos de microcentrífuga separados, lave los anticuerpos con 450 μL de tampón de unión IP helado 2 veces. Centrifugarlos a 100 x g durante 1 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
   2. Vuelva a suspender las perlas hasta una concentración de 0,5 mg/ml utilizando tampón de unión IP. (No haga vórtices de las cuentas). Después de alícuota la suspensión necesaria (50 μL de suspensión de anticuerpos 4G10 y 25 μL de suspensión de anticuerpos 27B10.4 por muestra) en un solo tubo, gire los tubos de centrífuga a 200 x g durante 1 minuto a 4 °C. Lave las paredes laterales con sobrenadante antes de devolver las perlas al almacenamiento en el refrigerador.
4. Agregue perlas de pY prelavadas a la solución de muestra resuspendida en los criotubos con tapón de rosca. Incubarlos a 4 °C en un rotor de extremo a extremo durante la noche.
5. Coloque los tubos criogénicos con tapón de rosca en un tubo de centrífuga de 50 ml forrado con una toallita delicada. Gira las cuentas a 100 x g durante 1 min. Guarde el sobrenadante, que se utilizará para enriquecer los péptidos pST.
6. Vuelva a suspender las perlas con 300 μL de tampón de unión IP. Transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 2 ml y gírelos a 100 x g durante 1 minuto a 4 °C.
7. Enjuague el tubo de incubación 3 veces con 200 μL de tampón de unión IP. Transfiera el contenido al mismo tubo de microcentrífuga cada vez. Luego, gíralos hacia abajo.
8. Lave las perlas en el tubo de microcentrífuga 3 veces con 500 μL de tampón de unión IP y gírelas a 100 x g durante 1 min. A continuación, lavar las perlas 4 veces con 450 μL de 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5, y girarlas a 100 x g durante 1 min. Utilice siempre una solución fresca de 25 mM de NH₄HCO₃ en polvo.
9. Centrifugar las perlas a 1.500 x g durante 1 min. Utilice una punta de carga de gel para eliminar completamente el sobrenadante sumergiendo la punta de la punta de carga de gel ligeramente por debajo de la superficie de las perlas.
10. Agregue 4 veces el volumen del cordón del 0,1% de TFA a los cordones (es decir, agregue 300 μL de 0,1% de TFA para 75 μg de suspensión de cordón pY). Mezclarlos bien e incubar la mezcla en una termobatidora a 1.000 rpm durante 15 min a 37 °C.
11. Transfiera la resuspensión a un filtro de centrifugado de 0,2 μm. Gire rápidamente el tubo de elución y transfiera el volumen residual al mismo filtro de centrifugación con una pipeta P10. Gire el filtro de centrifugado a 850 x g durante 1 min. Transfiera la elución a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Concentre al vacío el eluido hasta que se seque durante la noche a 40 °C y con un tiempo de calor de 300 min.
    nota: El experimento se puede pausar aquí. Congele las muestras a -80 °C y continúe en una fecha posterior.

Tabla 1: Tampones y soluciones.Esta tabla muestra las composiciones de los búferes y las soluciones utilizadas en este protocolo.

búfer	volumen	composición
Tampón de lisis de cloruro de guanidinio 6 M	50 mL	6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sodio, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glucósido, agua ultrapura a volumen
100 mM Pirofosfato de sodio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sodio decahidratado, agua ultrapura a volumen
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, agua ultrapura a volumen
5% Ácido trifluoroacético	20 mL	Agregue 1 mL de ácido trifluoroacético 100% en 19 mL de agua ultrapura
Ácido trifluoroacético al 0,1%	250 mL	Agregue 5 ml de ácido trifluoroacético al 5% a 245 ml de agua ultrapura
tampón de elución pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Tampón de elución pST	250 mL	0,1 % de ácido trifluoroacético, 50 % de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Búfer de enlace IP	200 mL	50 mM tris pH 7.4, 50 mM cloruro de sodio, agua ultrapura a volumen
25 mM Bicarbonato de amonio, pH 7,5	10 mL	Disolver 19,7 mg en 10 ml de agua ultrapura estéril, pH a 7,5 con ácido clorhídrico 1 N (~10-15 μL/10 ml de solución), hacer fresco
Tampón de fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de dihidrógeno fosfato de sodio, 577 mL 1 M de hidrogenofosfato de sodio
Tampón de equilibrio	14 mL	6,3 ml de acetonitrilo, 280 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 1740 μL de ácido láctico, 5,68 ml de agua ultrapura
Tampón de enjuague	20 mL	9 mL de acetonitrilo, 400 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 10,6 mL de agua ultrapura
Solución de espectrometría de masas	10 mL	500 μL de acetonitrilo, 200 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 9,3 mL de agua ultrapura
Búfer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 5 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
Búfer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 350 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
0,9% Hidróxido de amonio	10 mL	300 μL 29,42% de hidróxido de amonio, 9,7 mL de agua ultrapura

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vacío de sobremesa CentriVap	Labconco	7810010
Toallitas Kimwipes	Fisher Científico	06-666A
Filtro de centrifugado Millipore de 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubos de Eppendorf de baja unión a proteínas	Eppendorf	22431081
anti-Fosfotirosina, Agarosa, Clon: 4G10	Millipore Sigma	16101
Anticuerpo 27B10.4	Citoesqueleto	Cuentas APY03
Kit de ensayo de péptidos	Termo Científico	23275
Consejo superior	PolyLC Inc	TT200TIO.96
Columnas SCX (PoliSULFOETILO A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Jeringa de 3 mL	Bd	309657
Agua MilliQ			Agua desionizada utilizada para preparar todas las soluciones y tampones
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrilo (ACN)	Fisher Científico	A21-1
Cloruro de potasio	Fisher Científico	BP366-500
ácido láctico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Hidróxido de amonio	Fisher Científico	A669S-500
Base Tris	Fisher Científico	BP152-5