Enriquecimiento de fosfopéptidos: una técnica de inmunoprecipitación basada en anticuerpos para separar péptidos fosforilados específicos de mezclas de péptidos complejos

Resumen

Fuente: Cheng, L. C., et al. Enriquecimiento de fosfopéptidos junto con espectrometría de masas cuantitativa sin etiquetas para investigar el fosfoproteoma en el cáncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018).

En este video, demostramos la inmunoprecipitación de fosfopéptidos basada en anticuerpos a partir de una mezcla de péptidos. Los fosfopéptidos enriquecidos se concentran al vacío y se almacenan para su análisis posterior.

Protocolo

>1. Inmunoprecipitación y enriquecimiento de péptidos pY

1. Vuelva a suspender el polvo liofilizado de péptidos purificados con 0,5 mL de tampón de unión a inmunoprecipitación (IP) frío como hielo en cada fracción. Agrupe las fracciones transfiriendo el volumen de resuspensión de 0,5 ml de la segunda fracción a la primera fracción y guarde la punta de la pipeta. Vórtice vigorosamente (en lugar de pipetear hacia arriba y hacia abajo) para garantizar que la muestra se disuelva por completo antes de transferirla a un criotubo con tapón de rosca de 3,6 mL.
2. Enjuague los tubos de liofilización con otros 0,5 mL de tampón de unión IP (

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vacío de sobremesa CentriVap	Labconco	7810010
Toallitas Kimwipes	Fisher Científico	06-666A
Filtro de centrifugado Millipore de 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubos de Eppendorf de baja unión a proteínas	Eppendorf	22431081
anti-Fosfotirosina, Agarosa, Clon: 4G10	Millipore Sigma	16101
Anticuerpo 27B10.4	Citoesqueleto	Cuentas APY03
Kit de ensayo de péptidos	Termo Científico	23275
Consejo superior	PolyLC Inc	TT200TIO.96
Columnas SCX (PoliSULFOETILO A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Jeringa de 3 mL	Bd	309657
Agua MilliQ			Agua desionizada utilizada para preparar todas las soluciones y tampones
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrilo (ACN)	Fisher Científico	A21-1
Cloruro de potasio	Fisher Científico	BP366-500
ácido láctico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Hidróxido de amonio	Fisher Científico	A669S-500
Base Tris	Fisher Científico	BP152-5