Enriquecimiento de fosfopéptidos a base de dióxido de titanio: un método para el aislamiento selectivo de fosfopéptidos de la biblioteca de péptidos

>1. Dióxido de titanio Enriquecimiento de péptidos pY

1. Vuelva a suspender los fosfopéptidos secos en 200 μL de 50% ACN, 0,1% TFA. Vórtice y centrifugarlos a 10.000 x g durante 30 s. Repita esto 1 vez para volver a suspenderlos bien.
2. Preparación de las perlas de TiO₂ contenidas en puntas que tienen una capacidad para muestras de 200 μL.
   1. Golpee suavemente el lado pequeño de la punta para mover el material hacia ese extremo. Enjuague la punta agregando 200 μL de ACN 100%, luego invirtiendo la punta y moviendo el extremo pequeño para mover el líquido hacia la tapa.
   2. Con una cuchilla de afeitar, corta el extremo pequeño de la punta y colócala sobre un tubo de baja unión a proteínas. (Evite usar tubos de poliestireno, ya que el TiO₂ se pegará a los lados del tubo). Retire el tapón e inserte una micropipeta para extraer el ACN restante. Repetir el lavado con 200 μL de 100% ACN. Las perlas de TiO₂ ahora se encuentran en el tubo de unión a proteínas bajas para los siguientes pasos.
   3. Preacondicionar TiO₂ con 500 μL de 100% ACN 2x. Pipetear para mezclar las perlas con el disolvente. Centrifugarlos a 100 x g durante 1 min.
   4. Condición TiO₂ con 500 μL de tampón de fosfato de sodio 0,2 M (pH ~7) 2x. Lavar las perlas con 300 μL de tampón de equilibrio 3x. Debido a que TiO₂ es muy denso, las cuentas se asentarán rápidamente.
3. Añadir 400 μL de 50% de ACN, 0,1% de TFA en el tubo de baja unión a proteínas, seguido de la adición de 84 μL de ácido láctico. Transfiera los fosfopéptidos resuspendidos al tubo de unión a proteínas bajas e incube durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un rotador de extremo a extremo.
4. Centrifugar las perlas a 100 x g durante 1 min para pelletizarlas. Lávelos con 300 μL de tampón de equilibrio (Tabla 1) 2 veces y gírelos a 100 x g durante 1 min.
5. Enjuague las perlas con 300 μL de tampón de enjuague 2 veces y transfiérelas a un filtro de centrifugado de 0,2 μm. Gíralos a 1.500 x g durante 1 min.
6. Transfiera la unidad de filtro a un tubo limpio de 1,5 mL de baja unión a proteínas. Eluir el contenido 2x con 200 μL de 0,9% NH₃ en H₂O. Mida el pH con tiras de pH, que deben estar entre 10 y 11. Concentrar al vacío el eluido para que se seque durante la noche para evaporar el amoníaco.

Tabla 1: Tampones y soluciones.Esta tabla muestra las composiciones de los búferes y las soluciones utilizadas en este protocolo.