Enriquecimiento de fosfopéptidos a base de dióxido de titanio: un método para el aislamiento selectivo de fosfopéptidos de la biblioteca de péptidos

Abstract

Fuente: Cheng, L. C. et al. Enriquecimiento de fosfopéptidos junto con espectrometría de masas cuantitativa sin marcaje para investigar el fosfoproteoma en el cáncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra el enriquecimiento a base de dióxido de titanio de fosfopéptidos extraídos del tejido tumoral de próstata. Estos fosfopéptidos enriquecidos se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como la caracterización de proteínas, para comprender las vías de señalización celular involucradas en la progresión del cáncer de próstata.

Protocol

>1. Dióxido de titanio Enriquecimiento de péptidos pY

1. Vuelva a suspender los fosfopéptidos secos en 200 μL de 50% ACN, 0,1% TFA. Vórtice y centrifugarlos a 10.000 x g durante 30 s. Repita esto 1 vez para volver a suspenderlos bien.
2. Preparación de las perlas de TiO₂ contenidas en puntas que tienen una capacidad para muestras de 200 μL.
   1. Golpee suavemente el lado pequeño de la punta para mover el material hacia ese extremo. Enjuague la punta agregando 200 μL de ACN 100%, luego invirtiendo la punta y moviendo el extremo pequeño para mover el líquido hacia la tapa.
   2. Con una cuchilla de afeitar, corta el extremo pequeño de la punta y colócala sobre un tubo de baja unión a proteínas. (Evite usar tubos de poliestireno, ya que el TiO₂ se pegará a los lados del tubo). Retire el tapón e inserte una micropipeta para extraer el ACN restante. Repetir el lavado con 200 μL de 100% ACN. Las perlas de TiO₂ ahora se encuentran en el tubo de unión a proteínas bajas para los siguientes pasos.
   3. Preacondicionar TiO₂ con 500 μL de 100% ACN 2x. Pipetear para mezclar las perlas con el disolvente. Centrifugarlos a 100 x g durante 1 min.
   4. Condición TiO₂ con 500 μL de tampón de fosfato de sodio 0,2 M (pH ~7) 2x. Lavar las perlas con 300 μL de tampón de equilibrio 3x. Debido a que TiO₂ es muy denso, las cuentas se asentarán rápidamente.
3. Añadir 400 μL de 50% de ACN, 0,1% de TFA en el tubo de baja unión a proteínas, seguido de la adición de 84 μL de ácido láctico. Transfiera los fosfopéptidos resuspendidos al tubo de unión a proteínas bajas e incube durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un rotador de extremo a extremo.
4. Centrifugar las perlas a 100 x g durante 1 min para pelletizarlas. Lávelos con 300 μL de tampón de equilibrio (Tabla 1) 2 veces y gírelos a 100 x g durante 1 min.
5. Enjuague las perlas con 300 μL de tampón de enjuague 2 veces y transfiérelas a un filtro de centrifugado de 0,2 μm. Gíralos a 1.500 x g durante 1 min.
6. Transfiera la unidad de filtro a un tubo limpio de 1,5 mL de baja unión a proteínas. Eluir el contenido 2x con 200 μL de 0,9% NH₃ en H₂O. Mida el pH con tiras de pH, que deben estar entre 10 y 11. Concentrar al vacío el eluido para que se seque durante la noche para evaporar el amoníaco.

Tabla 1: Tampones y soluciones.Esta tabla muestra las composiciones de los búferes y las soluciones utilizadas en este protocolo.

búfer	volumen	composición
Tampón de lisis de cloruro de guanidinio 6 M	50 mL	6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sodio, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glucósido, agua ultrapura a volumen
100 mM de pirofosfato de sodio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sodio decahidratado, agua ultrapura a volumen
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, agua ultrapura a volumen
Ácido trifluoroacético al 5%	20 mL	Agregue 1 mL de ácido trifluoroacético 100% en 19 mL de agua ultrapura
Ácido trifluoroacético al 0,1%	250 mL	Agregue 5 ml de ácido trifluoroacético al 5% a 245 ml de agua ultrapura
tampón de elución pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Tampón de elución pST	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 50% de acetonitrilo, agua ultrapura a volumen
Búfer de enlace IP	200 mL	50 mM tris pH 7.4, 50 mM cloruro de sodio, agua ultrapura a volumen
25 mM de bicarbonato de amonio, pH 7,5	10 mL	Disolver 19,7 mg en 10 ml de agua ultrapura estéril, pH a 7,5 con ácido clorhídrico 1 N (~10-15 μL/10 ml de solución), hacer fresco
Tampón de fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de dihidrógeno fosfato de sodio, 577 mL 1 M de hidrogenofosfato de sodio
Tampón de equilibrio	14 mL	6,3 ml de acetonitrilo, 280 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 1740 μL de ácido láctico, 5,68 ml de agua ultrapura
Tampón de enjuague	20 mL	9 mL de acetonitrilo, 400 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 10,6 mL de agua ultrapura
Solución de espectrometría de masas	10 mL	500 μL de acetonitrilo, 200 μL de ácido trifluoroacético al 5%, 9,3 mL de agua ultrapura
Búfer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 5 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
Búfer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotásico (pH 2,65), 30% de acetonitrilo, 350 mM de cloruro de potasio, agua ultrapura a volumen
Hidróxido de amonio al 0,9%	10 mL	300 μL 29,42% de hidróxido de amonio, 9,7 mL de agua ultrapura

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colector de vacío	Restek	26080
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vacío de sobremesa CentriVap	Labconco	7810010
Rotador de extremo a extremo	ThermoFisher Scientific	415110Q
cuchilla	Fisher Científico	620177
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Tubos cónicos Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientific	12-565-268
Filtro de centrifugado Millipore de 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubos de Eppendorf de baja unión a proteínas	Eppendorf	22431081
anti-Fosfotirosina, Agarosa, Clon: 4G10	Millipore Sigma	16101
Kit de ensayo de péptidos	Termo Científico	23275
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrilo (ACN)	Fisher Científico	A21-1
ácido láctico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Hidróxido de amonio	Fisher Científico	A669S-500
Fosfato de potasio monobásico	Fisher Científico	BP362-500
Cloruro de potasio	Fisher Científico	BP366-500
Cloruro de calcio dihidratado	Fisher Científico	BP510-500
Base Tris	Fisher Científico	BP152-5
MonoTip	PolyLC Inc	TT200TIO.96