Modelado del cáncer de próstata en modelos de ratón modificados genéticamente: una técnica de edición de genes localizados mediada por CRISPR/Cas9 en células del lóbulo anterior de la próstata de ratón

Abstract

Fuente: Riedel, M. et al. Virus Entrega de guías CRISPR a la próstata murina para la alteración genética. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe un método para editar genes específicos en células de la glándula prostática utilizando un sistema de administración basado en adenovirus. El enfoque permite la alteración ortotópica y localizada de la expresión génica utilizando la tecnología CRISPR para desarrollar nuevos modelos de ratón para el cáncer de próstata.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Transmisión del virus a la próstata murina

1. Anestesiar al animal mediante inyección intraperitoneal con una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27G x 1/2". Utilice una dosis de anestesia de 0,01 mL/g de peso corporal. Si el procedimiento dura más de 30 minutos, mantenga la anestesia inyectando 1/3 de la dosis inicial cada 30 minutos.
2. Examine la profundidad anestésica evaluando la relajación muscular, el retiro del pedal y los reflejos palpebrales. Cuando se observe pérdida de reflejos, afeitar la parte inferior del abdomen del animal.
3. Cubra cuidadosamente los ojos del animal con ungüento oftálmico veterinario utilizando un hisopo de algodón estéril para prevenir la ceguera por falta de reflejo corneal.
4. Limpie el abdomen afeitado con un 70% de etanol y un 10% de povidona yodada para desinfectar el área quirúrgica. Frote el área quirúrgica desde el centro del área quirúrgica hacia la periferia.
5. Realice una incisión vertical en la piel en la línea media abdominal inferior de aproximadamente 1 cm con una tijera quirúrgica estéril.
6. Levante el peritoneo con pinzas de punta fina para evitar dañar los órganos que se encuentran debajo. Realice con cuidado una incisión de <8 mm con tijeras quirúrgicas a través del peritoneo.
   NOTA: A diferencia de los humanos, la glándula prostática de un roedor consta de cuatro lóbulos separados. El lóbulo anterior está unido a la vesícula seminal.
7. Mueve suavemente el tejido graso a un lado para descubrir la vesícula seminal. Con una pinza de anillo, levante con cuidado la vesícula seminal hasta que se pueda identificar la próstata anterior (Figura 1).
8. Inyecte un volumen total de 30 μL de solución para el virus (3 x 10¹⁰ partículas virales) en el epitelio anterior de la próstata utilizando una jeringa de insulina de 0,5 mL con una aguja de 30G x 8 mm. Minimice las fugas y asegúrese de que el líquido se absorba dentro del tejido, formando una pequeña burbuja. Vuelva a colocar la vesícula seminal en la cavidad abdominal.
9. Sutura el peritoneo con 2-3 puntos simples interrumpidos utilizando suturas reabsorbibles 6-0 con un círculo de 13 mm, 3/8 y una aguja de punta cónica.
10. Grapar la piel con tres pinzas estériles de 4,8 x 6,5 mm, levantando la piel con pinzas para evitar dañar el peritoneo.
11. Para una mejor recuperación, aplique el antídoto anestésico en una dosis de 0,01 mL/g de peso corporal mediante inyección intraperitoneal utilizando una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27G x 1/2". Vuelva a colocar al animal con cuidado en su jaula.

Results

Figura 1: Ilustración del procedimiento. El procedimiento se lleva a cabo en el ratón Rosa26-LSL-Cas9-EGFP generado por Platt et al. La próstata anterior (AP) está unida a la vesícula seminal (SV). Las partículas de virus que expresan ARN guía y una proteína Cre se inyectan en la próstata anterior para alterar la expresión génica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J ratones	El Laboratorio Jackson	26175
Jeringa de insulina U-100 de 0,5 ml	Bd	324825	para inyección de virus
Jeringa de 1 ml	Bd	300013	para inyección de anestesia
Aguja de 30 G 1/2''	Bd	304000	para inyección de anestesia
Sutura de polisorbo 6-0	Medtronic	GL889	para cerrar el peritoneo
Paño de cirugía esterilizado desechable	Múltiples proveedores
Almohadilla térmica	Múltiples proveedores
Almohadilla de preparación de povidona y yodo	Fisher Científico	06-669-70
Máquina recortadora	Esculapio	GT415	para afeitar el abdomen
Pinzas Dumont	F.S.T	11252-00
Halsey Micro Portaagujas	F.S.T	12500-12
Tijeras de iris	F.S.T	14094-11
Pinzas de patrón estrecho	F.S.T	11002-12
Pinzas de anillo	F.S.T	11106-09
Mango del sistema de clip para heridas incl. Clips	F.S.T	12030-01	para cerrar la piel
Removedor del sistema de clip para heridas	F.S.T	12030-04
1x PBS	Gibco	10010-023
Antisedán			obtenidos del animalario
Butorfanol			obtenidos del animalario
Clorhidrato de medetomidina			obtenidos del animalario
Midazolam			obtenidos del animalario
100% Etanol	Fisher Científico	22-032-103
Ungüento para los ojos	Takeda	7242
Virus (AAV, AV)	Múltiples proveedores		virus utilizado en este protocolo es una producción propia