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1. Tratamiento con bisulfito
- Utilice 45 μL de la solución de tejido digerido como muestra.
- Realice el tratamiento con bisulfito utilizando reactivos en un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Añadir 5 μL de tampón de dilución a la muestra de ADN e incubar a 37 °C durante 15 min (ver Tabla de Materiales).
- Mientras se incuban las muestras, prepare el reactivo de conversión de bisulfito añadiendo 750 μL dedH2O y 210 μL de tampón de dilución a un tubo de reactivo de conversión CT (consulte la Tabla de materiales). Mezcle los tubos mediante vórtice durante 10 min.
- Después de los 15 minutos de incubación, añadir 100 μL del reactivo de conversión CT preparado a cada muestra y mezclar por inversión.
- Incubar las muestras en la oscuridad a 50 °C durante 12 a 16 h.
- Después de la incubación, retire las muestras y colóquelas en hielo durante 10 minutos.
- Añadir 400 μL de tampón aglutinante y mezclar cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo (ver Tabla de Materiales). Cargue cada muestra en una columna de centrifugado y coloque la columna en un tubo de recolección de 2 mL (consulte la Tabla de materiales).
- Centrifugar cada muestra a máxima velocidad (10.000 x g) durante 1 min y desechar el flujo.
- Añadir 200 μL de tampón de lavado a cada columna y centrifugar a máxima velocidad durante 1 min, descartando el flujo (ver Tabla de Materiales).
- Agregue 200 μL de tampón de desulfonación a cada columna y deje que la columna permanezca a temperatura ambiente durante 15 minutos (consulte la tabla de materiales). Después de la incubación, gire las columnas a toda velocidad durante 1 minuto y deseche el flujo.
- Añadir 200 μL de tampón de lavado a cada columna y centrifugar a máxima velocidad durante 1 min (ver Tabla de Materiales).
- Repita este paso una vez más.
- Agregue 46 μL de dH2O a cada columna y coloque cada columna en un nuevo tubo de polipropileno estéril de un solo uso de 1,5 mL (consulte la Tabla de materiales). Gira cada tubo durante 2 minutos para eluir el ADN.
- Retire cada columna de centrifugado del tubo de polipropileno de un solo uso y deséchelo (consulte la Tabla de materiales). El ADN ya está listo para el análisis.
>2. PCR cuantitativa específica de metilación (qMSP)
- Utilice el ADN modificado con bisulfito del paso 1.3 como plantilla para la PCR en tiempo real basada en fluorescencia en qMSP para evaluar la metilación de la región promotora en cada análisis de genes.
- Realice qMSP utilizando un instrumento de PCR en tiempo real de 96 pocillos (consulte la tabla de materiales).
- Compruebe el estado de metilación del promotor del gen diana en el ADN modificado con bisulfito utilizando un cebador directo de 200 nM, un cebador inverso de 200 nM y sondas de 80 nM. Prepare la mezcla maestra con 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM de β-mercaptoetanol, 10 nM de fluoresceína, 0,166 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido y 0,04 U/μl de ADN polimerasa (ver Tabla de Materiales). El volumen de reacción final en cada pocillo para todos los ensayos es de 25 μL.
- Realice el ciclo de qMSP de la siguiente manera: 95 °C durante 5 minutos, seguido de 55 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min.
NOTA: El gen objetivo debe elegirse en función de los criterios de tener valores beta más grandes, estar relacionado con las islas CpG en la región promotora y ser adecuado para el diseño de cebadores y sondas para qMSP.
- Utilice la genómica humana tratada con metilasa CpG (M.SssI) como control positivo de la metilación (ver Tabla de Materiales).
nota: La cuantificación final de la metilación se define como el valor relativo de metilación (RMV) y se calcula como 2–ΔΔCt para cada repetición de detección de metilación en comparación con el Ct medio para la β-actina (ACTB). Las secuencias de cebadores y sondas se muestran en la Tabla 1. Se utiliza un Ct de 100 para las réplicas no detectadas, lo que da un valor de 2–ΔΔCt cercano a cero. Se utiliza la siguiente fórmula:
media 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
| gen | Delantero 5' - 3' | Reverso 5' - 3' | sonda |
| B-ACTINA | ETIQUETA: GGA, GTA, TAT, AGG, TTG, GGG, AAG, TT | AAC ACA CAA TAA CAA CAA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |