Criopreservación basada en vitrificación: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar muestras biológicas a temperaturas muy bajas para su almacenamiento a largo plazo

Resumen

Fuente: Lu, J. H. et al. Establecimiento de Modelos de Xenoinjertos Derivados de Pacientes con Cáncer Gástrico y Líneas Celulares Primarias. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos un método de criovitrificación ultrarrápido para preservar muestras biológicas. El método implica el uso de una combinación de crioprotectores para proteger el tejido biológico del daño por congelación al prevenir la formación de cristales de hielo intracelular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Criopreservación de tejidos

NOTA: Esta parte hace referencia principalmente a los métodos para el Kit de Tejido Vivo Cryo Kit. Los principales kits y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Eutanasiar a los ratones con un método aprobado por el IRB cuando el tumor tenga más de 10 mm de diámetro.
2. Con pinzas y tijeras estériles, aísle lentamente el tumor de los ratones.
3. Lavar los tejidos tumorales con DPBS en un plato de 10 cm. Diseccionar y extirpar áreas necróticas, tejido graso, coágulos de sangre y tejido conectivo con pinzas y tijeras.
4. Cortar los tejidos tumorales hasta un máximo de 1 mm de grosor con un molde.
5. Lavar las rodajas con DPBS en un plato de 10 cm.
   nota: El proceso de vitrificación implica el uso de tubos marcados como V1/V2/V3 en los pasos 1.6-1.8. Los ingredientes principales son DMSO y sacarosa.
6. Transfiera las rodajas al tubo V1 con pinzas e incube el tubo a 4 °C durante 4 min. Enrolle e invierta el tubo brevemente, y colóquelo a 4 °C durante otros 4 min.
7. Vierta la solución V1 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas al tubo V2 con pinzas e incube el tubo V2 a 4 °C durante 4 min. Enrolle e invierta el tubo brevemente, y colóquelo a 4 °C durante otros 4 minutos.
8. Vierta la solución V2 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas al tubo V3 con pinzas e incube el tubo a 4 °C durante 5 min. Enrolle e invierta el tubo brevemente, y colóquelo a 4 °C durante al menos 5 minutos. Asegúrate de que todas las rodajas se hundan hasta el fondo del tubo.
   1. Si quedan varias rodajas flotando, enrolle e invierta el tubo brevemente, y vuelva a colocar el tubo a 4 °C hasta que todas las rodajas se hundan completamente; si es necesario, deseche las rodajas flotantes.
9. Vierta la solución V3 y las rodajas en un plato de 10 cm.
10. Corte los soportes de pañuelos a la longitud adecuada y colóquelos sobre una gasa estéril. Transfiera las rodajas a los soportes. Envuelva los soportes con la gasa y colóquelos en nitrógeno líquido con pinzas, seguido de la incubación durante 5 minutos.
11. Etiquete los viales criogénicos con la información del tejido.
12. Transfiera los soportes con rodajas de tejido a viales criogénicos, que se almacenan en nitrógeno líquido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de tejido vivo Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghái, China	LT2601
Moldes y cuchillas auxiliares procesados por tisú	Celliver Biotechnology, Shanghái, China	LT2603
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghái, China	L40601