Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de LDN de lavados de cavidad abdominal
- Adquisición de muestras
- Infundir 1.000 mL de solución salina estéril normal directamente en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes que se han sometido a cirugía abdominal debido a una neoplasia maligna gastrointestinal.
nota: Se obtuvieron muestras de pacientes que se sometieron a gastrectomía, colectomía o esofagectomía sin sesgos basados en la edad o el sexo. La solución salina se transfirió a un recipiente y se vertió en todo el abdomen en un minuto. Se realiza de forma rutinaria como un lavado peritoneal postoperatorio sin efectos significativos en los pacientes.
- Lave la cavidad abdominal extensamente durante al menos 1 min.
nota: Se recomienda agitar lentamente el líquido infundido con las manos del cirujano para que las muestras sean uniformes.
- Recupere 200 mL de líquido de lavado con cuatro jeringas de 50 mL.
nota: A veces, se utiliza un conector de goma para absorber los fluidos.
- Realizar la purificación de la LDN peritoneal utilizando mAb específico de granulocitos, CD66b
nota: Debido a que la capa intermedia después de la centrifugación en gradiente de densidad contiene muchas células mononucleares, se realizó una selección positiva de neutrófilos polimorfos utilizando CD66b mAb.
- Transfiera el líquido de lavado peritoneal a un tubo de 50 mL.
nota: En este paso, pase los fluidos a través de un filtro de nailon de 100 μm para eliminar las impurezas.
- Centrifugar el líquido peritoneal a 270 x g durante 7 min en RT.
- Vuelva a suspender los pellets en 5 mL de PBS con 0.02% de EDTA.
- Superponga cuidadosamente los 5 mL de suspensión celular en una solución de gradiente de densidad de 3 mL.
- Centrifugar a 1.700 x g durante 15 min a RT sin pausas.
- Coseche alrededor de 2 a 3 mL de una solución que contenga las capas intermedias (Figura 1A) usando una pipeta y mezcle con 10 mL de PBS con 0.02% de EDTA.
- Centrifugar el líquido peritoneal a 400 x g durante 7 min a RT y desechar el sobrenadante.
- Añadir otros 10 mL de PBS con EDTA al 0,02% y centrifugar a 270 x g durante 7 min en RT. Deseche el sobrenadante.
- Disuelva el pellet de celda (1 x 107) en 60 μL de tampón para el kit de separación de celdas magnéticas.
- Añadir 20 μL de bloque Fc a los pellets e incubar durante 10 min a 4 °C.
- Añadir 20 μL de anti-CD66b conjugado con microperlas e incubar durante 10 min más a 4 °C.
- Lavar y resuspender los pellets en 500 μL de tampón MACS.
- Aplique la suspensión de celdas a una columna magnética en el campo magnético de un separador magnético adecuado y recoja el flujo continuo que contiene celdas CD66b(-) lavando la columna con 15 mL de tampón.
- Retire la columna del separador magnético y enjuague inmediatamente las celdas CD66b(+) marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
nota: La población de células CD66b(+) consiste principalmente en neutrófilos según lo determinado por el análisis FACS, lo que indica que el >95% de la fracción CD66(+) son positivas para CD11b, CD15 y CD16, pero negativas para CD14.
