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>1. Tinción de células tumorales con colorante enlazador de células fluorescentes rojas
- Prepare las líneas celulares de cáncer humano MKN45, NUGC y OCUM-1.
- Lavar 1 x 107 celdas con PBS + 0,02% EDTA en un tubo de 15 mL y centrifugar a 270 x g durante 7 min en RT.
- Añada 1 ml de solución para la tinción de tinte a los gránulos y pipetee suavemente.
- Disuelva 4 μL de colorante Cell Linker fluorescente rojo en 1 mL de solución para tinción y mezcle con la suspensión celular del paso 1.2.
- Incubar los pellets durante 4 min a RT.
- Agregue 4 mL de DMEM (10% FBS) para detener la reacción de tinción.
- Centrifugar 270 x g durante 7 min y desechar el sobrenadante.
- Repita los pasos 1.6 y 1.7 dos veces.
- Compruebe con un microscopio de fluorescencia (excitación = 551 nm, emisión = 567 nm) que las células tumorales estén teñidas de rojo.
>2. Análisis de la adhesión de las células tumorales a los TNE
- Cultivo de células de neutrófilos de baja densidad en una placa recubierta de poli-L-lisina de 6 pocillos (6 cm de diámetro) durante 2 h a 37 °C en CO2 al 5%, lo que permite la producción de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs
- Transfiera las células tumorales teñidas con fluorescente rojo (1 x 106) en 1 mL de RPMI 1640 suplementado con BSA al 0,1%.
- Agregue las células tumorales al cultivo de LDN que produjo los NET.
- Incubar durante 5 min a 37 °C, lo que permite que las células tumorales entren en contacto con los NETs.
nota: La incubación prolongada induce la adhesión de las células tumorales a la LDN o a las placas.
- Retire el medio y lave suavemente los pocillos agregando 2 mL de medio precalentado (0.1% BSA + RPMI 1640) y agitando el plato.
- Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.5 dos veces.
nota: Dado que los NET se adhieren débilmente a la placa, el lavado debe realizarse con la mayor suavidad posible para evitar la extracción de los propios NET.
- Añadir colorante verde fluorescente para teñir el núcleo y los cromosomas a una concentración final de 5 μg/mL para la visualización de los NETs.
- Observe los NET y las células tumorales adheridas utilizando los filtros apropiados (verde, excitación = 504 nm, emisión = 523 nm; rojo, excitación = 551 nm, emisión = 567 nm).
- Combine las figuras para mostrar las células tumorales que están atrapadas por los NETs.
nota: En algunos experimentos, se añadió una enzima de degradación del ADN al cultivo de LDN (concentración final de 100 U/mL) 5 min antes de la co-incubación durante 5 min.