Microscopía de fluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs: una técnica para observar la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NETs

Resumen

Fuente: Kanamaru, R. et al. Las trampas extracelulares de neutrófilos generadas por neutrófilos de baja densidad obtenidos del líquido de lavado peritoneal median el crecimiento y la unión de las células tumorales. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra la tinción fluorescente de trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos, los componentes extracelulares del ADN expulsados por los neutrófilos. Esta técnica permite la visualización de la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NET.

Protocolo

>1. Tinción de células tumorales con colorante enlazador de células fluorescentes rojas

1. Prepare las líneas celulares de cáncer humano MKN45, NUGC y OCUM-1.
2. Lavar 1 x 10⁷ celdas con PBS + 0,02% EDTA en un tubo de 15 mL y centrifugar a 270 x g durante 7 min en RT.
3. Añada 1 ml de solución para la tinción de tinte a los gránulos y pipetee suavemente.
4. Disuelva 4 μL de colorante Cell Linker fluorescente rojo en 1 mL de solución para tinción y mezcle con la suspensión celular del paso 1.2.
5. Incubar los pellets durante 4 min a RT.
6. Agregue 4 mL de DMEM (10% FBS) par....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinción de ácido nucleico verde SYTOX solución de 5 mM en DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	S7020
PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	P9691
RPMI1640 Medio	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	R8758
Polvo liofilizado de albúmina en suero bovino, ≥96% (electroforesis en gel de agarosa)	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	A2153
MICROPLACA RECUBIERTA de poli-L-lisina 6Well	IWAKI, Japón	4810-040
Microscopio estereoscópico de fluoresceína	BX8000, Keyence, Osaka, Japón	BZ-X710
Línea celular de cáncer gástrico humano MKN45	Riken, Tukuba Japón	N/A
Línea celular de cáncer gástrico humano NUGC-4	Riken, Tukuba Japón	N/A
Línea celular de cáncer gástrico humano OCUM-1	Universidad de la Ciudad de Osaka, Japón	N/A	Regalo del Dr. M. Yashiro
DNasa I	Worthington, Lakewood NJ	LS002138
Solución de 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)	Nacalai tesque, Japón	06894-14
Dulbecco's Modified Eagle Glucosa media-alta (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	D5796