Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de trampas extracelulares de neutrófilos o NET: una técnica para analizar la interacción posterior a la adhesión entre las células cancerosas y los NET

Resumen

Fuente: Kanamaru, R. et al. Las trampas extracelulares de neutrófilos generadas por neutrófilos de baja densidad obtenidos del líquido de lavado peritoneal median el crecimiento y la unión de las células tumorales. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, analizamos el comportamiento post-adhesión de las células cancerosas atrapadas en trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) mediante el co-cultivo de neutrófilos de baja densidad y células de cáncer gástrico. El análisis de video de lapso de tiempo ayuda a monitorear varios eventos celulares y estudiar el papel de los NET en condiciones patológicas.

Protocolo

1. Análisis de video de lapso de tiempo de las células tumorales atrapadas

1. Cultivar las LDN peritoneales en una placa redonda de 35 mm recubierta con poli-L-lisina e incubar durante 2 h a 37 °C en CO₂ al 5%.
2. Agregue el colorante verde fluorescente para teñir el núcleo y los cromosomas para visualizar los NET a la concentración final de 5 μM.
3. Después de 1 min de incubación, retire el medio y agregue 2 mL de 0.1% BSA + RPMI 1640.
4. Retire el medio y agregue 1 x 10⁶ celdas MKN45 sin teñir suspendidas en 0.1% BSA + RPMI 1640. Incubar durante 5 min en RT.
5. Retire cualquier célula tumoral no adherida lavando suavemente el plato, agregando 2 ml de medio precalentado (0.1% BSA + RPMI 1640) y agitando el plato.
6. Repita el procedimiento de lavado anterior dos veces.
   nota: Dado que los NET se adhieren débilmente a la placa, el lavado debe realizarse con la mayor suavidad posible para evitar la extracción de los propios NET.
7. Añadir DMEM con FCS al 10% suplementado con 100 u/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
8. Monte la placa de cultivo en un sistema de observación celular de vista completa y seleccione el campo apropiado en el que las células tumorales son atrapadas por los NET.
9. Continúe con el cocultivo durante dos días adicionales y tome fotos continuas del campo cada 6 minutos bajo luz normal y fluorescencia, lo que detecta las células MKN45 y los NET, respectivamente.
10. Superponga las imágenes en cada punto de tiempo y construya videos de lapso de tiempo utilizando el software Image Viewer.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de tinción de ácido nucleico verde SYTOX de 5 mM en DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	S7020
RPMI1640 Medio	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	R8758
Dulbecco's Modified Eagle Glucosa media-alta (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	D5796
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	D8537
Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA	gibco de life technologies, México	10437-028
Polvo liofilizado de albúmina en suero bovino, ≥96% (electroforesis en gel de agarosa)	Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.	A2153
Penicilina Estreptomicina	Tecnologías de la Vida Japón	Números 15140-122
Profiláctico de plasmocina	InvivoGen, San Diego, CA-EE. UU	ANT-MPP
Microscopio estereoscópico de fluoresceína	BX8000, Keyence, Osaka, Japón	BZ-X710
Sistema de observación de celda de vista completa	Nikon, Kanagawa, Japón	BioStudio (BS-M10)
Línea celular de cáncer gástrico humano MKN45	Riken, Tukuba Japón	N/A

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