Preparación de bloques de exosomas: un protocolo para preservar exosomas de células de cáncer de colon humano cultivadas

Resumen

Fuente: Jung, M. K. et al. Preparación de muestras e imágenes de exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe la técnica de preparación de bloques de exosomas a partir de células tumorales gastrointestinales cultivadas. Estos bloques de exosomas se pueden cortar, teñir y obtener imágenes para determinar la posición de proteínas específicas en la vesícula de la bicapa lipídica.

Protocolo

>1. Preparación de bloques de exosomas

1. Granular los exosomas del sobrenadante de cultivo de células HCT116 por centrifugación a 100.000 x g durante 1,5 h. Retirar el sobrenadante de cultivo y fijar cuidadosamente el pellet de exosoma purificado con 1 mL de glutaraldehído al 2,5% en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,0) durante 1 h a 4 °C. Para cacodilato de sodio 0,1 M, disolver 4,28 g de ácido cacodílico en 160 mL de agua destilada (DW). Ajuste el pH a 7,4 con 0,1 M de HCl, luego haga hasta 200 mL con agua destilada.
2. Retire el fijador y enjuague los gránulos con 1 mL de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a temperatura ambiente. Repita tres veces, y cada cambio dura 10 minutos.
3. Fijar la muestra con 1 mL de tetróxido de osmio al 2% durante 1 h a 4 °C.
4. Retire el fijador y enjuague tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M cada 10 min.
5. Incubar durante 10 minutos con una serie de acetonas graduadas (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) en el agitador.
6. Retire la acetona e incube la solución de acetona:mezcla de inclusión de baja viscosidad 3:1 durante 30 min. La bolita de exosoma está en el tubo.
7. Retire el medio y agregue acetona: medio de mezcla de inclusión de baja viscosidad 1:1, luego incube durante 30 minutos.
8. Retire el medio y agregue acetona: medio de mezcla de inclusión de baja viscosidad 1:3, luego incube durante 30 min.
9. Retire el medio y agregue la mezcla de inclusión 100% de baja viscosidad e incube durante la noche a temperatura ambiente.
10. Incrustar la muestra en una mezcla de inclusión pura de baja viscosidad utilizando el molde de inclusión y hornear durante 24 h a 65 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glutaraldehído	ems	Año 16200
Cacodilato de sodio	ems	12300
Tetróxido de osmio 1 g cristal	ems	Año 19100	Úselo solo en campana extractora
acetona	JUNSEI	1B2031