Inmunotinción con oro de secciones exosómicas: una técnica para visualizar marcadores de diagnóstico en la luz exosomal

>1. Inmunotinción de secciones de exosomas e imágenes

1. Prepare secciones ultrafinas de 60 nm de un bloque de exosomas utilizando un ultramicrótomo y recójalas en una rejilla de níquel.
2. Incubar las rejillas en gotas de 50 μL de glicina 0,02 M durante 10 min para apagar los grupos aldehídos libres.
3. Enjuague con 100 μL de DW tres veces cada una durante 10 min. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en PBS que contenga 1% de BSA.
4. Incubar las rejillas en 50-100 μL de gotas de anticuerpo anti-KRS (1:100 en PBS que contenga 0,1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, este paso debe realizarse a 4 °C durante la noche).
5. Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS que contengan 0,1% de BSA durante 10 minutos cada una.
6. Transfiera las rejillas a gotas de anticuerpo secundario durante 1 h (IgG anti-conejo conjugada con partícula de oro de 10 nm (1:100) en PBS que contiene 0,1% de BSA).
7. Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS que contengan 0.1% de BSA cada 10 min.
8. Doble tinción con acetato de uranilo al 2% durante 20 min en condiciones de oscuridad y con citrato de plomo de Reynold durante 10 min, respectivamente.
9. Observar las rejillas bajo microscopía electrónica de transmisión a 80 kV.
10. Haga clic en "Adquirir" y luego haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara CCD bajo el TEM a 80 kV. El tiempo de exposición siguió los ajustes automáticos.