Inmunotinción con oro de secciones exosómicas: una técnica para visualizar marcadores de diagnóstico en la luz exosomal

Resumen

Fuente: Jung, M. K., Mun, J. Y. Preparación de muestras e imágenes de exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, demostramos la inmunotinción con oro de biomarcadores localizados dentro de la región lumínica de secciones exosomales ultrafinas. Esta técnica permite el diagnóstico precoz de enfermedades mediante la visualización de las moléculas diana dentro de los exosomas secretados por las células enfermas.

Protocolo

>1. Inmunotinción de secciones de exosomas e imágenes

1. Prepare secciones ultrafinas de 60 nm de un bloque de exosomas utilizando un ultramicrótomo y recójalas en una rejilla de níquel.
2. Incubar las rejillas en gotas de 50 μL de glicina 0,02 M durante 10 min para apagar los grupos aldehídos libres.
3. Enjuague con 100 μL de DW tres veces cada una durante 10 min. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en PBS que contenga 1% de BSA.
4. Incubar las rejillas en 50-100 μL de gotas de anticuerpo anti-KRS (1:100 en PBS que contenga 0,1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, este paso debe realizarse a 4 °C durante la noche).
5. Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS que contengan 0,1% de BSA durante 10 minutos cada una.
6. Transfiera las rejillas a gotas de anticuerpo secundario durante 1 h (IgG anti-conejo conjugada con partícula de oro de 10 nm (1:100) en PBS que contiene 0,1% de BSA).
7. Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS que contengan 0.1% de BSA cada 10 min.
8. Doble tinción con acetato de uranilo al 2% durante 20 min en condiciones de oscuridad y con citrato de plomo de Reynold durante 10 min, respectivamente.
9. Observar las rejillas bajo microscopía electrónica de transmisión a 80 kV.
10. Haga clic en "Adquirir" y luego haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara CCD bajo el TEM a 80 kV. El tiempo de exposición siguió los ajustes automáticos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetato de uranilo	ems	22400	Producto químico peligroso
Citrato de plomo	ems	Año 17900
Microscopía electrónica de transmisión	Hitachi	H7600
Rejilla de cobre	ems	G200-CU
glicina	sigma	022K5404
Tampón de fosfato salino	sigma	P4417
Albúmina sérica bovina	Aurión	25557
Anticuerpo antihumano CD274 (B7-H1, PD-L1) purificado	BioLeyenda	329710	Monte entero Immumogold
IgG2b de ratón purificada, κ Isotipo Ctrl	BioLeyenda	401202	Montura entera Immumogold (Control)
2ª partícula de oro conjugada IgG anti-ratón de 9-11 nm	sigma	G7652
Paraformaldehido	ems	Año 19210