Tinción negativa de exosomas purificados: un procedimiento para visualizar la morfología de los exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Fuente: Jung, M. K. et al. Preparación de muestras e imágenes de exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe un procedimiento para la tinción negativa de exosomas purificados. Los exosomas teñidos negativamente se obtienen mediante microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica ayuda a visualizar la morfología de los exosomas.

Protocolo

1. Tinción negativa

1. Descargue incandescente las rejillas EM de cobre de malla 200 recubiertas con película de formvar / carbono delgadas durante 1 minuto mediante un descargador de incandescente.
2. Fije los exosomas purificados con 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 2% durante 5 min.
   NOTA: Los vapores de paraformaldehído son tóxicos. Todo el trabajo debe realizarse en una campana extractora ventilada.
3. Cargue 5-7 μL de solución de suspensión de exosomas en la rejilla e incube durante 1 min. Si la concentración de exosoma es demasiado alta, diluya la concentración a la mitad o a un quinto.
4. Teñir inmediatamente con las ~20 gotas de solución filtrada de acetato de uranilo (UA) al 1% en la superficie de la rejilla EM con una jeringa.
5. Retire el exceso de solución de UA en la rejilla contactando el borde de la rejilla con papel de filtro.
6. Enjuague rápidamente la rejilla con una gota de agua. Este paso eliminará el exceso de solución para manchar.
7. Coloque la rejilla sobre la mesa sosteniéndola con pinzas y cubra la rejilla parcialmente con un plato de cultivo para que se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Almacene la cuadrícula en una caja de cuadrícula EM para su observación futura por un TEM a 80 kV.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetato de uranilo	ems	22400	Producto químico peligroso
Microscopía electrónica de transmisión	JEOL	JEM2200FS
Descargador de incandescencia	JEOL	JFC1100E
Paraformaldehido	ems	Año 19210
Formvar recubierto de carbono Cobre Rejilla (malla 200)	ems	FCF200-CU
Formvar Nickel recubierto de carbono Rejilla (malla 200)	ems	FCF200-NI