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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Congelación y montaje muscular
- Sumerja la mitad inferior de un vaso de plástico pequeño (50 ml) que contenga isopentano en nitrógeno líquido. El isopentano está listo para usar cuando se vuelve ligeramente viscoso y forma un laminado blanco sólido que recubre el interior del vaso de precipitados (temperatura: -160 °C).
nota: Utilice siempre herramientas manuales de bronce o aluminio que no produzcan chispas. Evite respirar el vapor del producto. Úselo con ventilación adecuada. Si lidiar con un derrame y la ventilación es imposible o poco práctico, use un respirador adecuado.
- Congele un poco de medio de inclusión en un mandril (corcho) sumergiéndolo brevemente (10 s) en isopentano.
- Manipule el músculo (por ejemplo, el tibial o el gastrocnemio) sosteniéndolo por el tendón, verticalmente en relación con el corcho, para mantener la orientación de las fibras y permitir secciones transversales.
- Coloque con cuidado la parte final del músculo fresco sobre el medio de inclusión congelado.
nota: El músculo se pegará. Es importante NO rodear completamente el músculo con medio de inclusión. También es importante mantener la orientación vertical para la posterior determinación del área de la sección transversal.
- Sumerja el mandril con el músculo adherido en el baño de isopentano (el tiempo de congelación habitual es de 7-15 s, dependiendo del tamaño y la composición de la muestra).
nota: La inmersión en la solución de congelación no debe durar más de lo necesario para congelar completamente la muestra. La congelación demasiado larga fracturará el bloque de tejido, mientras que un tiempo demasiado corto provocará la formación de cristales de hielo. Un espécimen bien congelado será de color blanco tiza.
- Después de congelar la muestra, colóquela en una pequeña bolsa de plástico o tubo de muestra (50 mL) y guárdela inmediatamente en un congelador a -80 °C o en nitrógeno líquido.
>2. Sección muscular
- Ajuste la temperatura de trabajo de la cámara interior del criostato a unos -23 °C.
- Deje que la muestra (previamente almacenada a -80 °C) se aclimate a la temperatura de trabajo (un par de horas deberían ser suficientes).
- Corte varias secciones de 8 μm de grosor de la muestra (preferiblemente los músculos tibial anterior o gastrocnemio) y recójalas en portaobjetos de vidrio.
nota: Corta la sección en la región media del abdomen del músculo y luego, en aras de la precisión, corta las secciones perpendicularmente al eje de montaje.
- Mantenga los portaobjetos de vidrio dentro de la cámara de criostato. No dejar que se descongelen si el objetivo es realizar estudios de IF/IHQ o tinción enzimática.
- Guarde los portaobjetos a -80 °C para realizar análisis posteriores.