Preparación de la montura completa del intestino del ratón: uso de un simple dispositivo de incisión intestinal para preparar la montura completa

Resumen

Fuente: Yoneda, M. et al. Un dispositivo sencillo para preparar rápidamente monturas enteras del intestino del ratón. J. Vis. Exp. (2015)

En este vídeo, demostramos la preparación de la montura completa del intestino del ratón utilizando un sencillo dispositivo de incisión intestinal. Las monturas resultantes son de calidad superior y uniforme y se pueden utilizar para análisis histológicos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Dispositivo

1. Mecanizar la parte principal de la base del dispositivo a partir de un bloque sólido de resina acetilo de alta densidad, como se describe en este manuscrito. En cada extremo, cree tiras de 3 mm de altura y separe la máquina con estas ranuras de 2,5 mm para tomar las varillas (consulte la Figura 1 y la Figura 2).
2. Fabrica varillas de acero inoxidable de 2,4 mm de diámetro con extremos redondeados.
nota:El marco principal de la tapa se mecanizó a partir de una placa de duraluminio.

>2. Uso del dispositivo

1. Diseccionar el intestino delgado y el colon de la cavidad abdominal con tijeras y dedos enguantados. Retire el mesenterio sosteniéndolo con pinzas curvas y tirando suavemente de él para separarlo del intestino.
2. Enjuague los intestinos con solución salina fría tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) utilizando una punta de pipeta tipo Gilson, que se ha cortado en su extremo más ancho para que pueda caber en una jeringa de plástico de 10 o 20 mL de ajuste luer.
3. Coloque el intestino delgado (SB) en una hoja de toalla de papel y divídalo en tres secciones iguales de longitud (proximal, media y distal: SB1, SB2 y SB3) con unas tijeras. Retira el ciego y extiende el colon.
4. Haga varios cortes muy pequeños en los segmentos intestinales con unas tijeras para permitir que el líquido escape y coloque una hoja de toalla de papel sobre los intestinos y pase suavemente un dedo sobre las preparaciones para exprimir el líquido y secar.
5. Levante las secciones e inserte las varillas de acero inoxidable que previamente se humedecieron sumergiéndolas en un vaso de precipitados de solución salina tamponada con fosfato.
   nota: El intestino se puede invertir si así se desea (al revés).
6. Etiquete un pedazo de cartulina o papel de filtro cortado a medida para que quepa en la base del dispositivo. El lápiz es el mejor, ya que no se ve afectado por prácticamente todas las soluciones. Se sugiere la fecha de la autopsia, el código experimental y el número de identificación del animal.
7. Coloque la tarjeta o el papel de filtro en la base del dispositivo. Inserte las varillas y los intestinos en las ranuras de la base del dispositivo. Asegúrese de que el extremo proximal de los segmentos esté colocado de manera estandarizada. Los extremos proximales deben estar cerca de las etiquetas de la tarjeta.
8. Coloque la pieza superior del dispositivo sobre la base. Utilice las barras en ángulo para guiar una hoja de bisturí para cortar las secciones longitudinalmente.
   nota: Es útil si el pañuelo se sujeta suave y cuidadosamente con un dedo para asegurarse de que no se mueva con el cuchillo.
9. Retire la pieza superior del dispositivo. Retire con cuidado el papel de filtro y los pañuelos de papel (aún en sus varillas).
   nota: Un pedazo de cartulina rígida colocado debajo del papel de filtro ayudará a levantarlo.
10. Ligeramente mojados (con la yema de un dedo enguantado mojado en PBS) los segmentos. Enrolle la varilla, de lado a lado, para abrir la tripa y extenderla. A continuación, el pañuelo se adherirá al papel de filtro.
11. Examine visualmente las preparaciones para cualquier lesión macroscópica.
12. Transfiera el pañuelo adherido al papel de filtro a un baño poco profundo (o caja de sándwich) que contenga un fijador.
    nota: Después de que el pañuelo se adhiera al papel de filtro o a la tarjeta, permanecerá firmemente adherido. Se puede utilizar una amplia gama de fijadores para conservar la preparación. Se recomienda utilizar el líquido de Carnoy para el estudio de la proliferación de células intestinales, que es la fijación ideal para los mejores métodos de proliferación celular; Sin embargo, también se puede usar formalina o muchos otros fijadores si se requieren otros puntos finales.
13. Después de la fijación (generalmente 3 h), transfiera las preparaciones a etanol al 70%. A continuación, las muestras se pueden almacenar hasta que se necesiten. Las preparaciones pueden estudiarse en la cara y/o utilizarse para la preparación de muestras histológicas para H&E u otras técnicas de tinción histológica, inmunohistoquímica y/o hibridación in situ.
    nota: La fijación prolongada puede reducir la reactividad inmunohistoquímica y/o la reactividad de hibridación in situ. Las cajas para sándwiches de polipropileno son ideales para almacenar una gran cantidad de preparaciones.
14. Si es necesario, los tejidos fijados de los distintos segmentos intestinales pueden convertirse en "rollos suizos" y teñirse con toda la gama de métodos histológicos, incluidos los descritos anteriormente. Para hacer un "rollo suizo", los segmentos intestinales se retiran del papel de filtro, se enrollan alrededor de un palillo de cóctel o un palillo de dientes, se aseguran con un alfiler entomológico y se procesan para la inclusión en cera.
15. Si es necesario, tiña el tejido a granel con azul de metileno para visualizar los focos aberrantes de las criptas.
16. Marque las preparaciones fijas en su tiempo libre.

Resultados

Figura 1. Fotos del dispositivo original.El dispositivo original fue construido a partir de varias piezas de metal, preparadas a mano. (A) El dispositivo ensamblado. (B) La parte superior del dispositivo se ha retirado para mostrar las varillas en posición.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Delrin	Ryan Plastics, Earls Barton, Reino Unido		Resina acetálica de alta densidad, un material similar sería suficiente
Placa de duraluminio	Suministros de metal Ltd., Park Road, Dukinfield. SK16 5LP Reino Unido		Permiten que datan de 1909, por lo que hay disponibles proveedores alternativos
Dispositivo(s) terminado(s) listo para usar	Póngase en contacto con el Dr. Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk		Póngase en contacto con r.goodlad@imperial.ac.uk para obtener más información sobre el suministro