Aislamiento de células mononucleares Lamina Propria: una técnica de centrifugación en gradiente de densidad basada en sílice para obtener células mononucleares a partir del colon murino

Resumen

Fuente: McManus, D. et al. Aislamiento de células mononucleares de lámina propia del colon murino utilizando colagenasa E. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos el aislamiento de células mononucleares de lámina propia del tejido colónico murino mediante digestión enzimática utilizando colagenasa E y separación por gradiente de medios de separación por densidad a base de sílice. Las células mononucleares aisladas se pueden utilizar para el análisis posterior.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de soluciones

1. Como se describe en la Tabla 1, prepare el tampón de colon, el medio de separación de densidad a base de sílice 100%, el medio de separación de densidad a base de sílice 66%, el medio de separación de densidad a base de sílice 44%, el tampón de digestión de colagenasa E y el tampón FACS.
   1. Prepare el Tampón de Colon el día anterior al procedimiento y almacene durante la noche a 4 °C.....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 60 mm	Termo Científico	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
Pipeta serológica desechable de 10 mL	Corning	4100
Jeringa de 10 ml	Becton Dickinson	302995
Tubos cónicos no estériles de 15 mL	TruLine	TR2002
Aguja roma de 18 g	Becton Dickinson	305180
Pipeta serológica desechable de 25 mL	Corning	4250
Filtro de células de 40 μm de tamaño de poro	Corning	352340
Tubo Falcon de 50 mL	Corning	21008-951
Albúmina sérica bovina (BSA)	sigma	A4503-1KG
Tampón de fijación	Bioleyenda	420801
E. coli Colagenasa E de Clostridium histolyticum	sigma	C2139
EDTA, solución estéril de 0,5 m	Amresco	E177-500ML
Suero Fetal Bovino	Termo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Ciencias de la Vida	1708901
RPMI Medio	Corning	17-105-CV
Azida de sodio	VWR Ciencias de la Vida Amresco	97064-646
Azul de tripano	Lonza BioWhittaker	17-942E