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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de soluciones
- Como se describe en la Tabla 1, prepare el tampón de colon, el medio de separación de densidad a base de sílice 100%, el medio de separación de densidad a base de sílice 66%, el medio de separación de densidad a base de sílice 44%, el tampón de digestión de colagenasa E y el tampón FACS.
- Prepare el Tampón de Colon el día anterior al procedimiento y almacene durante la noche a 4 °C.
- Prepare medios de separación de densidad 100% a base de sílice el día anterior al procedimiento y almacene durante la noche a 4 °C, colocándolos a temperatura ambiente la mañana del procedimiento para descongelar.
- Prepare medios de separación a base de sílice al 66 % y al 44 % en la mañana del aislamiento, utilizando medios de separación de densidad 100 % a base de sílice a temperatura ambiente y tampón de colon.
- Mida la cantidad adecuada de colagenasa E derivada de Clostridium histolyticum y almacene a -20 °C durante la noche anterior al procedimiento. A la mañana siguiente, disuelva en el volumen apropiado de Colon Buffer para obtener Collagenase Digestion Buffer. Para todas las incubaciones con tampón de digestión colagenasa el día del procedimiento, precaliente las soluciones a 37 °C.
- Para todos los pasos del protocolo, mantenga una centrífuga a 20 °C y una velocidad de rotación de 859 x g, con los frenos desactivados (0 desaceleración) para la centrifugación en gradiente. Ajuste otro a 4 °C y una velocidad de rotación de 859 x g, con la deceleración estándar, para los pasos de lavado.
>2. Cosechando el colon
- Eutanasia del ratón mediante asfixia por CO2 seguida de un método de confirmación aprobado por la AALAC.
- Coloque el ratón en posición supina y rocíe el pelaje con etanol al 70%. Con unas tijeras de tejido grandes, haga una incisión vertical en la línea media y exponga el peritoneo intacto.
- Con unas tijeras de disección finas, abra el peritoneo. Use fórceps para mover el intestino delgado hacia un lado y exponer el colon descendente. Tire ligeramente hacia arriba en el colon descendente para exponer al máximo la porción rectal del colon. Cortar el recto distal profundamente en la pelvis y diseccionar y extirpar todo el colon como una unidad, desde el recto distal hasta el capuchón cecal.
- Transfiera el colon en 20 mL de tampón de colon enfriado en un tubo de polipropileno de 50 mL.
>3. Limpieza del colon
- Coloque el colon sobre una toalla de papel humedecida y extraiga las heces sólidas aplicando una presión leve en la pared intestinal con el extremo romo de unas tijeras o fórceps.
- Coloque el colon en una placa de Petri y enjuague el intestino con 10 ml de tampón de colon enfriado con una jeringa de 10 ml con una aguja de llenado romo de 18 g.
- Transfiera el colon a una toalla de papel humedecida con Colon Buffer y retire el mesenterio y la grasa con el extremo afilado de las tijeras.
- Coloque el colon en una placa de Petri llena de 5-10 mL de tampón de colon refrigerado, agitando manualmente para lavar el contenido colónico restante. Repita 2-3 veces.
- Corte el colon longitudinalmente desde su extremo rectal más musculoso hasta el colon proximal (generando una sola pieza rectangular de colon abierto) en una placa de Petri llena de Tampón de colon fresco y frío. Deseche los medios existentes y vuelva a llenarlos con un tampón de colon limpio y refrigerado.
- Lave el intestino 3 veces agitándolo vigorosamente en la placa de Petri y reemplazando los 5-10 ml de tampón de colon enfriado después de cada lavado.
- Coloque el tejido de colon rectangular sobre una toalla de papel humedecida con Colon Buffer y córtelo cortándolo horizontalmente y luego en fragmentos pequeños (secciones de 3 mm x 3 mm).
- Recoja los fragmentos de colon cuidadosamente con pinzas finas en un tampón de colon enfriado de 20 ml en un tubo cónico de polipropileno de 50 ml.
- Lave los fragmentos de colon tres veces, cada lavado con 20 ml de tampón de colon, agitando vigorosamente el tubo durante 30 s. Entre cada agitación, permita que los fragmentos de tejido se depositen en el fondo del tubo. Decantar o aspirar al vacío el sobrenadante evitando la pérdida de fragmentos de tejido en el proceso de aspiración entre cada lavado.
nota: No es necesario cambiar el tubo después de cada lavado.
4. Cogenasa Digestión 1
- Agregue 20 mL del tampón de digestión de colagenasa a los fragmentos de colon lavados en el tubo cónico de polipropileno de 50 mL.
- Coloque el tubo cerrado de 50 ml a 37 °C en un agitador orbital incubado con la velocidad de rotación establecida en 2 x g durante 60 min. Asegúrese de que los fragmentos de tejido estén en constante movimiento durante la agitación; si es necesario, aumente la velocidad de rotación gradualmente para asegurarse de que ningún fragmento de tejido se deposite en el fondo del tubo.
>5. Preparar gradientes de medios de separación a base de sílice
- Prepare medios de separación de densidad a base de sílice al 66 % y al 44 %, utilizando medios de separación de densidad a base de sílice al 100 % a 20 °C (temperatura ambiente) y tampón de colon.
- Vierta 5 mL de medios de separación de densidad a base de sílice al 66% en cada uno de los 3 tubos de polipropileno de 15 mL separados. Prepare tres tubos por colon. Esto forma la base de mayor densidad del procedimiento de aislamiento de gradiente, sobre la cual se superpondrán medios de separación de menor densidad para crear el gradiente de separación.
- Conservar a 20 °C hasta su uso.
>6. Recolección de sobrenadante de la digestión 1
- Recoja solo el sobrenadante con una pipeta serológica de 25 mL y filtre el sobrenadante a través de un colador celular de tela de filtración de poros de 40 μm colocado en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 mL, después de completar la digestión de colagenasa 1. Tenga cuidado de no aspirar ningún fragmento de tejido existente.
NOTA: Conserve los fragmentos de tejido visible restantes en el tubo. Estos se someterán a una segunda digestión de colagenasa (paso 8).
>7. Tampón de digestión de colagenasa para apagar
- Llene completamente el tubo de polipropileno de 50 ml con Tampón de colon refrigerado.
nota: La colagenasa es activa a 37 °C; por lo tanto, el tampón refrigerado inactiva esta enzima.
- Centrifugar el tubo a 4 °C a 800 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante mediante aspiración endouterina. Lave las celdas con 25 mL de Tampón de colon fresco y centrifugue a 800 x g durante 5 min.
- Vuelva a suspender el pellet en menos de 1 mL de Tampón de Colon fresco y refrigerado.
- Coloque el tubo cónico de polipropileno de 50 mL sobre hielo.
>8. Cogenasa Digestión 2
- Repita el paso 4 (Digestión 1) con los fragmentos de tejido restantes retenidos del paso 6.1.
>9. Desagregación de tejidos después de la digestión 2
- Enjuague los fragmentos de tejido vigorosamente de un lado a otro entre el tubo y una jeringa de 10 ml a través de una aguja roma de 18 g.
- Repita este lavado durante un mínimo de 7-8 pasadas completas, continuando hasta que no se vean fragmentos de tejido grueso o desechos.
10. Filtrar celdas
- Pase la suspensión de desagregación de tejido a través de un filtro de células de tela de filtración de poros de 40 μm a un tubo de polipropileno limpio de 50 mL.
- Lave el colador de celdas de tela de filtración con 10 ml de tampón de colon enfriado para recuperar cualquier celda atrapada en el filtro.
>11. Calmar la digestión de la colagenasa
- Llene el tubo cónico de polipropileno de 50 ml hasta el borde con Colon Buffer enfriado.
NOTA: La temperatura del tampón de colon es fundamental para garantizar el enfriamiento de la actividad de la colagenasa.
- Spar a 4 °C y 800 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante mediante aspiración endouterina.
- Lavar resuspendiendo en 25 mL de Tampón de Colon fresco y refrigerado, seguido de centrifugación a 4 °C, 800 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante mediante aspiración endouterina.
- Agrupe el pellet resuspendido de la digestión de colagenasa 1 (paso 7) en su tubo correspondiente del paso 11.4.
- Repita el paso 11.4 (lavado y centrifugación).
12. Separación de densidad a base de sílice Separación en gradiente
de medios
NOTA: Realice los pasos 12-13 lo más rápido posible para asegurar un rápido apagado de la actividad de la colagenasa.
- Después del paso 11.7, vuelva a suspender cada gránulo en un total de 24 ml de medios de separación de densidad a base de sílice al 44% por colon.
- Aplique lentamente 8 mL del medio del paso 12.1 en cada uno de los tres tubos preparados en el paso 5.2 (que contienen un 66% de medios de separación de densidad a base de sílice), utilizando una pipeta serológica de 10 mL. Mantenga un flujo constante y lento de los medios de separación de densidad del 44% mientras superpone el gradiente para evitar interrupciones en la interfaz.
- Equilibre cuidadosamente todos los tubos dentro de los cubos de centrífuga con una báscula de pesaje o una balanza.
- Girar los tubos durante 20 min a 859 x g en una centrífuga sin freno a 20 °C. Deje que los rotores se detengan por completo antes de retirar los tubos, teniendo cuidado de no interrumpir las celdas en la interfaz de gradiente.
>13. Recoger células mononucleares de la interfaz de gradiente
- Visualice la interfaz de gradiente (cerca de la marca de 5 mL), donde normalmente está presente una banda blanca de 1-2 mm de espesor (que contiene MNC).
nota: Uno puede o no ver una banda blanca. Sin embargo, MNC estará en esta interfaz y debería nublar la claridad de la interfaz de gradiente.
- Aspire al vacío y deseche los 7 ml superiores del gradiente superior para permitir un acceso más fácil de la pipeta a la interfaz.
- Usando succión manual continua y movimiento giratorio constante de la muñeca, recoja la capa de interfaz de celdas en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 mL. Recoja hasta que la interfaz entre los dos gradientes sea clara y refractaria (libre de células).
- Llene el tubo de recolección con 50 ml de tampón FACS refrigerado. Centrifugar a 4 °C, 800 x g durante 5 min.
- Aspire el sobrenadante mediante aspiración al vacío y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tampón FACS.
- Cuente las células en un hemocitómetro a una dilución de 1:2 utilizando métodos apropiados de exclusión de células muertas.
- Proceda a la tinción de FACS u otros ensayos con MNC colónicos recién aislados.
Tabla 1: Tabla de preparación de soluciones
| solución | fórmula |
| Búfer de colon | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (inactivado por calor a 56oC durante 60 minutos, pH ajustado a 7,3) |
| Medios de gradiente de densidad a base de sílice 100% (por colon) | 22,5 mL de medios de gradiente de densidad a base de sílice + 2,5 mL de PBS 10x. |
| Medios de gradiente de densidad a base de sílice 66% (por dos puntos) | 10,72 mL de medios de gradiente de densidad a base de sílice 100% + 5,28 mL de tampón de colon |
| Medios de gradiente de densidad a base de sílice 44% (por dos puntos) | 11 mL de medio de gradiente de densidad a base de sílice 100% + 14 mL de tampón de colon |
| Tampón de digestión de colagenasa (por colon) | 100 U/mL de Colagenasa E de Clostridium histolyticum, disuelto en 40 mL de Tampón de Colon |
| Búfer FACS | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g Azida de sodio |