Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Establecimiento de organoides gástricos gástricos 3D derivados del ser humano
NOTA: Para evitar la contaminación, realice el protocolo en su totalidad dentro de una campana de cultivo de tejidos estéril. Se recolectó tejido fúndico humano de pacientes sometidos a gastrectomía en manga.
- Recoja el tejido de los pacientes que se someten a una gastrectomía en manga y colóquelo en la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) fría y sin Ca2+ en un recipiente de plástico grande.
- Con pinzas, lave el tejido enérgicamente en un vaso de precipitados estéril que contenga 100 mL de DPBS sin Ca2+/Mg2+. Lave durante aproximadamente 30 segundos o hasta que se hayan eliminado los residuos y la sangre. A continuación, con una gasa estéril, limpie la capa mucosa del epitelio.
- Con pinzas grandes, agarre firmemente la capa muscular del tejido y, con fuerza, raspe el epitelio con las pinzas hemostáticas curvas grandes. Recoja los fragmentos epiteliales raspados en una placa de Petri de poliestireno estéril.
- Picar el tejido epitelial en fragmentos de aproximadamente 2,0 x 2,0 mm2 con navajas para optimizar la digestión de los tejidos. Lavar los fragmentos de tejido con DBPS sin Ca2+/Mg2+ suplementado con antibióticos (DPBS sin Ca2+/Mg2+, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/ml de anfotericina B /10 mg/ml de gentamicina, 50 mg/ml de kanamicina), hasta que el lavado esté libre de sangre. Realice varios lavados si es necesario. Deseche el lavado filtrando cuidadosamente el lavado a través de una gasa estéril en un vaso de precipitados.
- Recoja los fragmentos lavados en un matraz de vidrio de fondo redondo de 125 mL con una barra de agitación de 25 mm y medios de incubación precalentados (medios basales suplementados con 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM de tampón HEPES, 1 mg/mL de colagenasa tipo 1, 2 mg/ml de albúmina sérica bovina de grado de cultivo celular). Selle el matraz de fondo redondo con tabiques de goma.
- Inserte una aguja espinal de 20 g en los tabiques y conéctela a un tanque de oxígeno con una manguera de goma. Para filtrar cualquier contaminante, inserte papel de seda en el tubo para crear un filtro. Encienda el flujo de salida de oxígeno a nivel bajo. Inserte de 10 a 15 agujas de salida en los tabiques para evitar la ruptura de los tabiques.
- Asegure el conjunto a un soporte de anillo con abrazaderas y colóquelo en un baño de agua calibrado a 37 °C con una placa de agitación durante 30-45 minutos. Después de que el tejido haya estado incubando durante 15 minutos, retire 50 μL de medio de incubación y verifique visualmente si hay glándulas disociadas. Si las glándulas no son densas o no se han separado del tejido, déjelas reposar durante 5 a 10 minutos más.
- Inmediatamente después de la incubación, añadir 50 ml de DMEM/F-12 precalentado a los medios de incubación utilizando una pipeta serológica estéril o vertiendo directamente en la mezcla de incubación.
- Filtre la mezcla de glándulas a través de una gasa estéril en cuatro tubos cónicos de 50 mL. Mantenga el filtrado en hielo durante 15 minutos para permitir que las glándulas extraídas se asienten en el fondo del tubo cónico. Tenga cuidado de no perturbar las glándulas asentadas; extraer y desechar los 40 ml superiores de sobrenadante con una pipeta serológica. Vuelva a suspender los 10 mL restantes en 10 mL de DPBS suplementado con antibióticos.
- Distribuya la mezcla uniformemente en tubos de ensayo de cultivo celular de 5 mL. Centrifugar durante 5 min a 65 x g a 4 °C y retirar el sobrenadante con cuidado con una pipeta.
nota: Es crucial realizar este paso sobre el hielo y evitar la polimerización de la matriz de la membrana basal durante la mezcla. Además, es importante inspeccionar visualmente la densidad de la glándula mediante un muestreo de 50 μL. La densidad óptima es de ~70% de confluencia.
- A continuación, coloque las glándulas en 50 μL de la matriz de la membrana basal con una pipeta de punta ancha. Evite producir burbujas durante el enchapado.
- Para permitir que la matriz de la membrana basal polimerice, incubar durante 10 a 15 min a 37 °C. Si se siembra en una placa de cultivo de 12 pocillos, agregue 1 mL de medio hFGO (medio Eagle modificado de Advanced Dulbecco/medio F-12 suplementado con 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B/10 mg/mL de gentamicina, 50 mg/mL de kanamicina, 10 mM de tampón HEPES, 1 mM de n-Acteylcistina, 1 x N2, 1 x B27, Medio condicionado al 50 % con Wnt, medio condicionado con R-espondina al 20 % suplementado con 100 ng/mL de inhibidor de la proteína morfogenética ósea, gastrina de 1 nM, factor de crecimiento epidérmico de 50 ng/mL, factor de crecimiento de fibroblastos 10 ng/mL, nicotinamida de 10 mM e inhibidor de ROCK Y-27632 de 10 μM) por pocillo. Si no usa una placa de cultivo de 12 pocillos, agregue suficiente medio para sumergir la burbuja de la matriz de la membrana basal.
- Cultive las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada al 5% deCO2. Cambie los medios cada 4-5 días.
