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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos
- Esteriliza en autoclave un juego de tijeras intestinales, tijeras normales y pinzas en un recipiente estéril.
- Coloque un plato de 96 pocillos (fondo plano) en una incubadora a 37 °C.
- Prepare 10 mL de medio de cultivo completo con los reactivos enumerados en la Tabla de Materiales.
- Incubar el medio completo a 37 °C en un baño de agua.
- Descongele la membrana basal reconstituida colocándola en un cubo de hielo. La membrana basal reconstituida se volverá líquida a 4 °C.
- Llene cuatro placas de Petri con solución salina fría tamponada con fosfato o PBS (4 °C).
>2. Aislamiento de las criptas del intestino delgado
- Sacrificio por inhalación de CO2 de un ratón T2 Lgr5-eGFP-IRES-CreER sobre un fondo C57BL6/J. Disecciona el peritoneo longitudinalmente con unas tijeras.
- Sujeta el estómago con las pinzas y córtalo transversalmente por la mitad.
- Con las tijeras intestinales a partir de ahora, extraiga el intestino y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS.
nota: Las tijeras intestinales tienen una punta afilada y roma. La punta roma de estas tijeras está destinada a no dañar la arquitectura de la cripta-vellosidades mientras abre el intestino.
- Comience colocando la punta roma en el estómago y empújela suavemente a través del píloro. Proceda cortando con las tijeras y tirando con las pinzas.
- Una vez abierto longitudinalmente todo el intestino delgado, lávelo con PBS frío sujetándolo con las pinzas y enjuáguelo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.
- Una vez que se hayan eliminado todos los restos de heces, proceda a aplanar el intestino en una tabla de cortar, con el lado luminal hacia arriba. El lado luminal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte externa.
- Con un portaobjetos de vidrio, retire suavemente las vellosidades raspando el intestino aplanado. Realice este paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido.
- Cortar el intestino delgado con una cuchilla quirúrgica estéril en trozos de 2 a 5 mm.
- Coloque los fragmentos del intestino delgado en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de PBS helado.
- Limpie los fragmentos de tejido, eliminando las impurezas restantes pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repita este paso hasta que el PBS esté completamente limpio.
- Agregue 15 mL de PBS frío para llevar el volumen final total de PBS a 25 mL. Añadir 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 45 min en un rodillo a 4 °C.
- Deseche el PBS/EDTA.
- Agregue 10 mL de PBS y separe las criptas pipeteando bruscamente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo (al menos tres veces). Recoge el sobrenadante.
- Repita el paso 2.13 cuatro veces. Agregue el medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mL.
- Granular las células por centrifugación (300 x g durante 5 min).
- Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio de cultivo y granule las criptas por centrifugación (80 x g durante 3 min).