Aislamiento de colonias de células cancerosas metastásicas a partir de CAM de pollo: un procedimiento para aislar células cancerosas a partir de cultivos de óvulos sin cáscara

Resumen

Fuente: Stoletov, K. et al. Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo rápido y cuantitativo de membrana corioalantoidea intravital de pollo. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos el aislamiento de colonias de células cancerosas metastásicas de la membrana corioalantoidea (CAM) de pollo utilizando cultivo de huevos sin cáscara. Este método ayuda a detectar factores que pueden ser responsables de la metástasis del cáncer.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento de colonias metastásicas

1. Al día 5 después de la inyección, retire los embriones de la incubadora e inspeccione las MCA de los embriones para ver si hay distribución de colonias metastásicas. Identificar los embriones con distribución uniforme de colonias en las que hay colonias compactas (o demasiado invasivas).
   nota: El proceso de cultivo de embriones de pollo no es estéril, por lo tanto, todos los pasos de cribado deben realizarse en condiciones altamente limpias para evitar la contaminación futura del cultivo de tejidos. La contaminación es bastante rara y se puede evitar fácilmente usando guantes y una mascarilla y usando solo herramientas estériles durante los procedimientos de inyección de células y aislamiento de colonias. Se recomienda inspeccionar los embriones uno por uno para disminuir su exposición a la temperatura ambiente del laboratorio y evitar la contaminación.
2. Localiza la colonia metastásica de interés. Una colonia compacta puede describirse como una con la mayoría de las células cancerosas ubicadas dentro de un área limitada en el tejido CAM (las células aparecen "agrupadas"). Una colonia invasora puede describirse como una colonia donde las células cancerosas se "dispersan" en el tejido CAM (Figura 1A, B).
   NOTA: La "compacidad" de la colonia metastásica puede explicarse por la inhibición de la invasión de células cancerosas, la inhibición de la proliferación de células cancerosas o ambas. Se debe prestar atención a todos los escenarios y se deben aislar las colonias de contacto (Figura 1A, B). Se puede utilizar un microscopio estereoscópico fluorescente simple para discriminar entre fenotipos de colonias metastásicas compactas e invasivas.
3. Bajo el microscopio de disección, tire suavemente del tejido CAM que contiene la colonia metastásica de interés hacia arriba con pinzas finas (Figura 1C).
4. Cortar el tejido CAM que contiene la colonia metastásica con unas tijeras quirúrgicas.
5. Transfiera el tejido CAM que contiene la colonia metastásica a un tubo vacío y estéril de 1,5 ml (en hielo) y cierre la tapa del tubo.
   nota: Las colonias aisladas pueden mantenerse en hielo hasta 3 h sin pérdida de viabilidad.
6. Repita el procedimiento de escisión hasta que todas las colonias de interés se recojan en tubos separados. Para evitar el sufrimiento de los animales, no extirpe más de 2 o 3 colonias de un embrión. Aplicar la eutanasia a los embriones congelándolos a -20 °C (u otro método aprobado) inmediatamente después de la escisión de la colonia.
7. Picar suavemente el tejido CAM en un tubo de microcentrífuga con una aguja estéril de 18G. Use una aguja separada para cada colonia.
8. Añadir 100 μL de solución de colagenasa 1x e incubar durante 30 min a 37 °C.
9. Gire las células y el tejido CAM a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Aspire la solución de colagenasa y resuspenda las células en medios completos utilizados para la línea celular de interés.
    nota: Normalmente, el tejido CAM no se disocia completamente después del tratamiento con colagenasa, y las células cancerosas proliferarán primero dentro de las piezas de tejido CAM y solo migrarán más tarde a la placa de cultivo de tejidos.
11. Vuelva a centrifugar las células y el tejido CAM a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
12. Resuspenda las células y los trozos de tejido CAM en 1 mL de medio completo más el factor de selección (si lo hay), luego transfiéralo a un solo pocillo en placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos.
    nota: Los fibroblastos CAM de pollo pueden persistir en el cultivo de tejidos por múltiples conductos, inhibiendo la expansión clonal. La capacidad de expandir las colonias metastásicas en presencia de un factor de selección (es decir, si un vector que se usó para hacer fluorescentes las células cancerosas también codifica un gen de resistencia a los antibióticos de mamíferos) puede acelerar en gran medida la expansión clonal. Se debe realizar un experimento de curva de muerte antes de la selección para asegurarse de que se utiliza la concentración adecuada de antibióticos.
13. Durante las próximas 1 a 3 semanas, controle las células cancerosas diariamente para detectar el crecimiento y la contaminación.
14. Cuando las células alcancen el 70-80% de confluencia, transfiéralas a una placa de cultivo de mayor volumen.
    nota: Se recomienda expandir las células hasta que se puedan congelar al menos dos viales criogénicos de cada clon. El mantenimiento de grandes cantidades de cultivo de tejidos puede ser laborioso e innecesario.
15. Proceda a la secuenciación o a la siguiente ronda de selección tan pronto como se alcance un número suficiente de células cancerosas. En general, 1 x 10⁶ de células cancerosas son suficientes para las técnicas modernas de secuenciación de alto rendimiento.
16. Proceda a la reinyección del clon y a la obtención de imágenes y cuantificación de la compacidad de la colonia o del contacto entre las células cancerosas y los vasos sanguíneos (Figura 2A). Alternativamente, proceda a la secuenciación de alto rendimiento o repita la selección de colonias.
    NOTA: Para disminuir el número de falsos positivos, se recomiendan al menos dos rondas de selección. Se han empleado con éxito dos enfoques. 1) Expandir cada clon y reinyectar individualmente para confirmar el fenotipo de la colonia. 2) Mezcle todos los clones expandidos en una proporción de 1:1 cada uno, vuelva a inyectar como una mezcla y repita el ciclo de selección.

Resultados

Figura 1. Resultados representativos de las diferentes etapas del protocolo de cribado.(A) Colonias metastásicas formadas por células heterogéneas (células HEp3 de la línea celular cancerosa transducida en biblioteca), 5 días después de la inyección. La flecha roja muestra una colonia compacta (posible golpe positivo) que debe ser extirpada. (B) Colonias ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL.	Corning	CLS430791-500EA
Calibre 18 x 1 1/2 BD precisión aguja	Bd	BD305196	Usamos 1.2mm x 40mm, es posible usar agujas más cortas si lo prefiere
Centrífuga de sobremesa.	Hay muchas fuentes disponibles		Cualquier centrífuga compatible con TC que se puede utilizar para girar hacia abajo las celdas es adecuado
colagenasa	sigma	C0130-100MG
bastoncillos de algodón	Hay muchas fuentes disponibles		debe esterilizarse antes de usar
Medios de cultivo apropiados para la célula Líneas utilizadas	Hay muchas fuentes disponibles		Cultivamos HT1080, HEp3 y b16 cell líneas en DMEM, 10% de medios FBS
Incubadora de huevos	Hay muchas fuentes disponibles		Un modelo exacto que es necesario depende de la escala de la pantalla. Las fuentes disponibles son: MGF Company Inc., Savannah, GA, o Lyon Electric Compañía Inc., Chula Vista, CA
Tubos Eppendor, 1,5 ml	sigma	T4816-250EA
Huevos fertilizados de Leghorn blanco	cualquier proveedor local
Pinzas finas	Hay muchas fuentes disponibles		Debe estar esterilizado antes de su uso
Software de análisis de imágenes			Utilizamos elementos de Nikon
PBS (1x)	Hay muchas fuentes disponibles
Platos de pesaje de plástico	Simport	CA11006-614	Las dimensiones son 78x78x25mm; muchos Otras fuentes están disponibles
tijeras quirúrgicas pequeñas	Hay muchas fuentes disponibles		debe esterilizarse antes de usar
Microscopio estereoffluorescente			Utilizamos Zeiss Lumar v12