Aislamiento y cultivo de células epiteliales de lengua murina: un procedimiento para aislar y cultivar células epiteliales de lengua a partir de un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Prasad, M. et al. Establecimiento in vitro de una línea celular murina de cáncer de cabeza y cuello modificada genéticamente utilizando un sistema Virus-Cas9 adenoasociado. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, describimos el aislamiento de células epiteliales de una lengua murina. Estas células pueden cultivarse posteriormente para dar lugar a colonias celulares.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento y cultivo de células primarias

1. Aplicar la eutanasia a un hombre o una mujer B6 de 6 semanas de edad; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia con CO₂ o cualquier otro protocolo aprobado por IACUC.
   nota: Estos ratones knockin CRISPR/Cas9 tienen una expresión dependiente de la recombinasa Cre de la endonucleasa cas9 y EGFP dirigida por un promotor CAG. La secuencia ascendente Lox-Stop-Lox (LSL) presente en el genoma de estos ratones impide la expresión de Cas9 y EGFP en ausencia de Cre recombinasa. Cuando se utilizan en combinación con ARN guía simple (ARNsg) y una fuente de Cre, permiten la edición de uno o varios genes de ratón in vivo o ex vivo.
2. Disecciona la lengua de los ratones sacrificados con tijeras quirúrgicas.
3. Disocie manualmente el tejido picando el tejido de la lengua en fragmentos muy pequeños con un bisturí. Recoja los fragmentos de tejido en un tubo de 15 mL que contenga 4,5 mL de medio simple RPMI (sin suero).
4. Agregue la mezcla de enzimas triples (200 μL) (consulte la Tabla 1 para obtener la receta) a los fragmentos de tejido.
5. Incubar la mezcla de tejido y enzima a 37 °C durante 30 min y golpear el tubo cada 10 min para mejorar la disociación enzimática del tejido.
6. Agregue un 5% de suero fetal bovino (FBS) que contenga HBSS/PBS a la mezcla de tejido y enzima para detener la acción de la enzima.
7. Filtre la suspensión celular anterior a través de una malla de nailon estéril de 70 μm para separar las células dispersas y los fragmentos de tejido más grandes.
8. Lavar la suspensión celular filtrada por centrifugación durante 300 x g durante 5 min en HBSS/PBS a RT.
9. Vuelva a suspender el pellet en medio de cultivo (10% FBS en RPMI/DMEM) y crezca en placas de cultivo de 60 mm hasta que se formen colonias celulares distintas.
   1. Los agregados celulares de cultivo se retienen en la parte superior del filtro en una placa de cultivo de 60 mm que contiene 3 mL de medio completo (10% FBS en RPMI/DMEM) hasta que se forman colonias celulares.
10. Examinar microscópicamente las células primarias para detectar la presencia de contaminación por fibroblastos después de 1 semana de cultivo. Tratar las células primarias desarrolladas a partir de agregados y suspensiones celulares con una solución de EDTA al 0,25 % de tripsina al 0,02% a 37 °C durante 1 min para eliminar los fibroblastos.
    nota: Por lo general, el cultivo primario a partir de agregados celulares produce más colonias en comparación con las suspensiones de una sola célula. Las células de estas colonias proporcionan una mejor eficiencia de transducción con la transducción AAV.

10X Solución Madre de Triple Enzima:
colagenasa	1 g de concentración final [10 mg/mL]
hialuronidasa	100 mg [1 mg/mL]
DNasa	20,000 Unidades conc. final [200 mg/mL]
PBS 1X	Preparación de hasta 100 mL

Tabla 1: Receta del tampón utilizado en este estudio

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepas de ratón
C57BL/6	Envigo
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Laboratorios Jackson	24857
cabeceo. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo
enzimas
Benzonase	sigma	E1014
Colagenasa IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
ADNasa	Thermo Fisher Scientific	18047019
hialuronidasa	MilliporeSigma	H3506
tripsina	Industrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Medios de cultivo, productos químicos y reactivos
Bsa	Amresco	0332-TAM-50G
DMEM	Industrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS	Industrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
HBSS	sigma	H6648
Pbs	Industrias Biológicas Israel BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Búfer Tris	MERCK Millipore	648311-1KG
Artículos de plástico
Filtro Amicon-ULTRA 100 KDa	Millipore	UFC910024
Filtros estériles de 0,22 μm, 4 mm	Millex	SLGV004SL
Filtros estériles de 0,45 μm, 13 mm	Millex	SLHV013SL
Placas de cultivo	Greiner Bio-One
Tubos de halcón	Greiner Bio-One