Pretratamiento tisular FFPE para ARN CISH: Un procedimiento para procesar secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina para la hibridación cromogénica in situ de ARN

Resumen

Fuente: Outh-Gauer, S. et al. Hibridación cromogénica in situ como herramienta para el diagnóstico del cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra los pasos involucrados en el pretratamiento de muestras de tejido FFPE para la hibridación cromogénica in situ de ARN. El proceso de pretratamiento ayuda a mantener la integridad de los ácidos nucleicos dentro de las células y la morfología general del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de los materiales

1. Preparación de 1x reactivo de recuperación de dianas
   1. En un vaso de precipitados grande, agregue 70 mL de reactivo de recuperación de objetivo 10x (consulte la Tabla de materiales) a 630 mL de agua destilada.
   2. Coloque el vaso de precipitados en una placa calefactora con un agitador magnético. Cúbrelo con papel de aluminio.
   3. Hervir su contenido a 100 °C durante 10–15 min.
      NOTA: No dejar hervir por más de 30 min.

>2. Pretratamiento de tejidos

NOTA: Estos pasos siguen la recomendación de pretratamiento "estándar" de acuerdo con las instrucciones del fabricante para muestras de cabeza y cuello. Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de las secciones 2.1 y 2.2 en función del tejido manipulado.

1. Bloqueo de la actividad de la peroxidasa
   1. Agregue 4-6 gotas de peróxido de hidrógeno (consulte la Tabla de materiales) a cada portaobjetos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos en agua destilada a temperatura ambiente.
2. Rotura de los enlaces ARN/tejido
   1. Con una garra, retire el papel de aluminio del reactivo de recuperación de objetivos 1x en ebullición (TTR1x) colocado en una placa calefactora y deje de agitar. Sumerja la rejilla deslizante lentamente y con mucho cuidado durante 15 minutos. Vuelva a cubrir el vaso de precipitados con papel de aluminio.
      nota: La cocción a fuego lento debe persistir durante este paso.
      cautela: Use la garra para manipular el papel de aluminio y la rejilla deslizante para evitar lesiones por quemaduras. Asegúrese de usar equipo de protección personal adecuado, como guantes y una bata de laboratorio.
   2. Con la garra, transfiera inmediatamente la rejilla de deslizamiento caliente a un baño de agua destilada y lávela durante 2 min.
      nota: Asegúrese de que las muestras no se enfríen en el TTR1x.
   3. Lave los portaobjetos en etanol 100% fresco durante 2 min.
   4. Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 2 minutos.
3. Creación de barreras
   1. Con un bolígrafo de barrera hidrofóbica (consulte la Tabla de materiales), dibuje una barrera alrededor de la muestra. Déjalo secar durante al menos 5 min.
      nota: Deja que la barrera se seque realmente. Si se desgasta durante el procedimiento, no dude en dibujarlo de nuevo. Evite tocar el pañuelo con la pluma. El protocolo se puede pausar durante la noche aquí.
4. Digestión de proteasas
   1. Coloque los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y agregue ~ 4 gotas de Proteasa Plus por muestra (consulte la Tabla de materiales).
   2. Cubra la bandeja de control de humedad con una tapa e insértela en el horno de hibridación durante 30 min a 40 °C.
      nota: Para evitar la evaporación, asegúrese de que la perilla giratoria esté completamente girada a la posición de bloqueo.
   3. Retire la bandeja del horno y retire la rejilla deslizante.
   4. Un portaobjetos a la vez, retire rápidamente el exceso de líquido y coloque el portaobjetos en una rejilla de portaobjetos sumergida en un plato de tinción lleno de agua destilada.
   5. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos en agua destilada a temperatura ambiente. Agita constantemente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Horno HybEZ (110v)	Diagnóstico Celular Avanzado Inc.	321710
Bastidor deslizante HybEZ	Diagnóstico Celular Avanzado Inc.	300104
Bolígrafo de barrera hidrofóbica ImmEdge	Diagnóstico Celular Avanzado Inc.	310018
RNAscope H202 y reactivo de proteasa más	Diagnóstico Celular Avanzado Inc.	322330	Peróxido de hidrógeno x2 y Proteasa Plus x 1
Reactivos de recuperación de dianas de RNAscope	Diagnóstico Celular Avanzado Inc.	322000