Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Ejecución del ensayo
NOTA: No permita que las secciones se sequen entre los pasos de incubación.
- Hibridación de la sonda HPV
NOTA: Asegúrese de que las sondas estén precalentadas para disolver cualquier precipitación antes de usarlas. Para este paso, en lugar de la sonda de VPH, también se puede utilizar la peptidil-prolil isomerasa B (PPIB) para el control positivo o la dihidrodipicolinato reductasa (DAPB) para el control negativo (ver la Tabla de Materiales).
- Golpee y/o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y colóquelos en la rejilla de portaobjetos. Agregue ~ 4 gotas de sonda de VPH para cubrir completamente cada sección.
- Cubra la bandeja con una tapa e insértela en el horno durante 2 h a 40 °C.
NOTA: Para evitar la evaporación, asegúrese de que la perilla giratoria esté completamente girada a la posición de bloqueo.
- Retire la bandeja del horno y retire la rejilla deslizante.
- Un portaobjetos a la vez, elimine rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en una rejilla de portaobjetos sumergida en un plato de tinción lleno de 1x tampón de lavado.
- Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con tampón de lavado nuevo 1x.
- Hibridación de AMP1, AMP2, AMP3 y AMP4
NOTA: Estos pasos incluyen la hibridación en el horno de hibridación y AMP1–AMP4 del kit comprado (consulte la Tabla de materiales).
- Toque y/o deslice para eliminar el exceso de líquido de los portaobjetos y colóquelos en la rejilla de portaobjetos. Agregue ~ 4 gotas de AMP1 para cubrir completamente cada sección.
- Cubra la bandeja con una tapa e insértela en el horno durante 30 minutos a 40 °C.
- Retire la bandeja del horno y retire la rejilla deslizante.
- Un portaobjetos a la vez, elimine rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en una rejilla de portaobjetos sumergida en un plato de tinción lleno de 1x tampón de lavado.
- Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con tampón de lavado nuevo 1x.
- Repita los pasos 1.2.1–1.2.5, pero use ~4 gotas de AMP2 en lugar de AMP1 e incube durante 15 minutos a 40 °C. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos, ambas veces en tampón de lavado nuevo.
- Repita los pasos 1.2.1 a 1.2.5, pero use ~ 4 gotas de AMP3 en lugar de AMP1 e incube durante 30 minutos a 40 ° C. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos, ambas veces en un tampón de lavado nuevo.
- Repita los pasos 1.2.1 a 1.2.5, pero use ~ 4 gotas de AMP4 en lugar de AMP1 e incube durante 15 minutos a 40 ° C. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos, ambas veces en un tampón de lavado nuevo.
- Hibridación de AMP5 y AMP6
NOTA: Estos pasos no incluyen la hibridación en el horno, sino la hibridación a temperatura ambiente. AMP5 y AMP6 provienen del kit comprado (consulte la Tabla de materiales).
- Golpee y/o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y colóquelos en la rejilla de portaobjetos. Agregue ~ 4 gotas de AMP5 para cubrir completamente cada sección.
- Cubra la bandeja con una tapa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Un portaobjetos a la vez, elimine rápidamente el exceso de líquido y colóquelo en una rejilla de portaobjetos sumergida en un plato para tinturas lleno de 1x tampón de lavado.
- Lave los portaobjetos en 1x tampón de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con tampón de lavado nuevo 1x.
- Repita los pasos 1.3.1 a 1.3.4, pero use ~ 4 gotas de AMP6 en lugar de AMP5 e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos, ambas veces en un tampón de lavado nuevo.
