Detección de señales de ARN CISH: una técnica para detectar señales cromogénicas durante la hibridación in situ de ARN en muestras de tejido intacto

1. Preparación de reactivos contratinantes

1. Prepare hematoxilina al 50%.
   1. En una campana extractora, agregue 100 mL de hematoxilina I de Gill (consulte la Tabla de Materiales) a 100 mL de agua destilada en un plato de tinción><. nota: La solución de tinción de hematoxilina al 50% se puede reutilizar hasta por 1 semana.
2. Prepare agua con amoníaco al 0,02% (p/v) (reactivo azulado).
3. En la campana extractora, agregue 1,43 mL de hidróxido de amonio 1 N a 250 mL de agua destilada en un cilindro graduado u otro recipiente. Selle el cilindro con una película de parafina. Mezcle bien su contenido durante 3x–5x.
   nota: Para la cuantificación del ensayo, es fundamental utilizar hidróxido de amonio. Los reactivos pueden prepararse con anticipación. Asegúrese de que todos los contenedores permanezcan cubiertos.

2. Detección de señales con 3,3'-diaminobenzidina

>PRECAUCIÓN: La diaminobenzidina (DAB) es tóxica. Siga las precauciones y pautas de seguridad adecuadas al desechar y manipular este producto químico.

1. Mezcle volúmenes iguales de DAB-A y DAB-B (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de tamaño adecuado dispensando el mismo número de gotas de cada solución. Prepare ~120 μL de sustrato DAB por sección (~2 gotas de cada reactivo/total de 4). Mézclalo bien de 3 a 5 veces.
2. Tome cada portaobjetos, uno a la vez, de la rejilla de portaobjetos y golpee y/o deslice para eliminar el exceso de líquido antes de colocarlo en el estante de portaobjetos.
3. Pipetea ~120 μL de DAB en cada sección de tejido. Asegúrese de que las secciones estén cubiertas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Deseche el DAB restante de acuerdo con la normativa local e inserte el portaobjetos en una rejilla de portaobjetos sumergida en un plato de tinción lleno de agua del grifo.

>3. Contratinción

1. Mueva la rejilla deslizante a un plato de tinción que contenga una solución de tinción de hematoxilina al 50 %, déjela reposar durante 30 s a temperatura ambiente. Ten en cuenta que las diapositivas se volverán moradas.
2. Transfiera inmediatamente la rejilla de portaobjetos a un plato para tinturas que contenga agua del grifo y lave los portaobjetos de 3 a 5 veces moviendo la rejilla hacia arriba y hacia abajo.
3. Siga repitiendo el paso de lavado con agua dulce del grifo hasta que los portaobjetos estén limpios mientras las secciones permanecen moradas.
4. Reemplace el agua del grifo en el plato de tinción con agua con amoníaco al 0,02%. Mueva el estante hacia arriba y hacia abajo 2x-3x. Tenga en cuenta que la sección de tejido debe volverse azul.
5. Reemplace el agua amoniacal con agua del grifo. Lave los portaobjetos de 3 a 5 veces.

>4. Deshidratación

1. Mueva la rejilla deslizante a un plato de tinción que contenga un 70% de etanol en la campana extractora y déjela reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
2. Mueva la rejilla deslizante a un primer plato de tinción que contenga etanol al 100% y déjelo reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
3. Mueva la rejilla deslizante a un segundo plato de tinción que contenga etanol al 100% y déjelo reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
4. Mueva la rejilla deslizante a un plato de tinción que contenga xileno y déjela reposar durante 5 minutos con agitación ocasional.

>5. Montaje de corredera

1. Retire las correderas de la rejilla de correderas y colóquelas planas, con las secciones hacia arriba en la campana extractora.
2. Monte una diapositiva a la vez agregando 1 gota de un medio de montaje a base de xileno a cada diapositiva y colocando cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm sobre la sección. Evite atrapar burbujas de aire.
3. Seque los portaobjetos al aire durante ≥5 min.

>6. Evaluación de muestra

1. Examine las secciones de tejido bajo un microscopio de campo claro estándar con un aumento de 20x a 40x.