Recolección de DRG de la columna vertebral de la rata: un procedimiento para extraer el ganglio de la raíz dorsal de la columna vertebral de un modelo de rata

Resumen

Fuente: Schmidt, L. B. et al. El modelo in vivo de membrana corioalantoica de pollito para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos la extracción del ganglio de la raíz dorsal o DRG de la columna vertebral de una rata cosechada para aplicaciones posteriores.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cosecha y Preparación de GRD (tiempo estimado: 2 h, día 8)

NOTA: Los experimentos con ratones y ratas requieren la aprobación de la IACUC. En algunos países, el uso de huevos de gallina también requiere aprobación.

1. Obtenga ratas Sprague Dawley de seis a siete semanas de edad (~ 200 g de peso) para extraer DRGs.
   nota: Una rata debería producir ~40 DRG cervicales y torácicas. El DRG del ratón también se integra en el CAM; Sin embargo, las condiciones para esta especie deben optimizarse de forma independiente.
2. En una cabina de flujo laminar, recoja los GRD de las regiones cervical y torácica siguiendo el protocolo para la extracción de GRD en ratones publicado en otros lugares. Siga la Figura 1 para obtener orientación sobre cómo cosechar DRG.
   1. Eutanasia de la rata mediante punción cardíaca después de la administración de ketamina/xilacina inyectada por vía intraperitoneal. Limpie la piel de la rata con etanol al 70% y retire la columna vertebral de la rata con una tijera. No realice una luxación cervical porque esto dañaría los GRD cervicales.
   2. Separe las regiones cervical, torácica y lumbar con la misma tijera, siguiendo la representación anatómica esquemática y las imágenes macroscópicas proporcionadas en la Figura 1A-D. Coloque las secciones del lomo en una placa de cultivo de 10 cm con 1X PBS para mantener los pañuelos húmedos.
   3. Con una tijera de hueso delicada, abra los huesos vertebrales en los aspectos dorsal y ventral, separando la columna vertebral en dos mitades laterales (Figura 1E-F) y coloque las secciones de tejido en un plato limpio de 10 cm con PBS fresco 1X.
   4. Con fórceps, separe suavemente la médula espinal de los huesos vertebrales para visualizar los GRD (Figura 1G).
   5. Con pinzas finas sostenidas debajo de cada GRD, agárrelo y sáquelo de la cavidad ósea en la que está alojado. No sostenga el DRG directamente porque esto causará daño a los tejidos. No recorte los haces de axones del DRG (Figura 1H).
      nota: Evite el uso de DRG lumbares, ya que estos tienen una integración reducida en la CAM. Para la ubicación de la región DRG, siga la ilustración esquemática y las imágenes anatómicas brutas de la Figura 1A-D.
3. Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada DRG en un medio de cultivo DMEM suplementado con un 2% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) y un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor para ayudar a prevenir la contaminación bacteriana de los GRD. Agrupe todos los GRD en la misma placa de cultivo de 6 cm con 4 mL de medio de cultivo.
4. Después de cosechar todos los DRG, transfiéralos a una nueva placa de cultivo con medio de cultivo DMEM complementado con 2% de Pen/Strep más 10% de FBS y que contenga 1,25 μg/mL de colorante rojo fluorescente. Incubar durante 1 h en la incubadora de cultivos celulares.

Resultados

Figura 1: Extracción de DRG el día 8. A. Esquema de rata que ilustra la ubicación anatómica de la columna vertebral. B. Diagrama de la configuración de las vértebras de la rata que muestra diferentes regiones del cuerpo; verde para las cervicales, azul oscuro para las torácicas, naranja para las lumbares y azul claro para las vértebras sacras. C-D...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PBS (1x) pH 7.4	Gibco	# 10010-023	Solución salina tamponada con fosfato
Ratas Sprague Dawley (hembras)	Laboratorios Charles River	Código de cepa: 001	6-7 semanas de edad (190-210 g de peso)
Pinzas finas Dumont # 5	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	# 11254-20	Se utiliza para cosechar DRG
Pinza Graefe extrafina, curvada	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	# 11151-10	Se utiliza para injertar DRG en el CAM el día 8 y para recolectar tejido CAM el día 17
Pinzas Graefe extrafinas, rectas	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	# 11150-10	Se utiliza para injertar DRG en el CAM el día 8 y para recolectar tejido CAM el día 17
DMEM (1x)	Gibco	# 11965-092	Dulbeecco's Modified Eagle Medium
Tinte fluorescente CellTracker Red CMTPX	Tecnologías de la Vida	# C34552	Reconstituya 50 μg en 40 μL de DMSO y almacene a -20 °C. Utilice 1 μl de solución madre/ml de medio de cultivo
Pluma/Estreptococo	Gibco	# 15140-122	10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina
HOLA FBS	Gibco	# 10082-147	Suero fetal bovino inactivado por calor
Dmso	Biorreactivos de Fisher	# BP231-100	Dimetilsulfóxido