Membrana corioalantoidea de pollo o modelo tumoral CAM: un método in ovo para simular la invasión perineural de células tumorales

Resumen

Fuente: Schmidt, L. B. et al. El modelo in vivo de membrana corioalantoica de pollito para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, describimos el método para co-cultivar ganglios de la raíz dorsal y células cancerosas en la membrana corioalantoidea de pollo o CAM para estudiar la invasión perineural.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Injerto de DRG en la CAM (tiempo estimado: 40 min, día 8)

1. Prepare una placa de cultivo de 6 cm con medio HBSS para lavar los GRD antes de la implantación. Lleve los huevos preparados a la cabina de flujo laminar de cultivo celular. Retire la membrana de parafina del huevo (Figura 1A).
2. Con pinzas estériles finas, agarre suavemente un DRG desde el interior del medio de cultivo. Sumérjalo en el medio HBSS para eliminar el exceso de medio que contiene el tinte fluorescente. Sostenga el DRG muy suavemente; de lo contrario, se adherirá a las pinzas.
3. Coloque el DRG en el CAM, teniendo cuidado de no perforar la membrana (Figura 1B-C). Si es necesario, use otro par de pinzas para ayudar a separar el DRG de la punta de las pinzas cuando lo coloque en el CAM.
   nota: Mantener el DRG húmedo con medio HBSS también facilitará el desprendimiento de las pinzas.
4. Cubra el huevo con un apósito de película transparente estéril. Cubra todas las ventanas y perforaciones hechas en la cáscara del huevo para evitar la contaminación bacteriana (Figura 1D).
5. Después de injertar GRD en todos los huevos, incubar los huevos en una incubadora humidificadora a 38 °C y 54% de humedad durante 2 días, sin rotación.

>2. Injerto de células tumorales en la MCA (tiempo estimado: 1 h 30 min, día 10)

1. A las 48 h antes de injertar las células, coloque las células necesarias en placas de cultivo. Calcular de 0,5 a 1 x 10⁶ células por óvulo para las células UM-SCC-1 con el fin de generar tumores tridimensionales en la CAM. Tenga en cuenta que el número de celdas puede variar según la línea celular.
2. Aspire el medio y agregue el medio de cultivo DMEM suplementado con 1% de Pen/Strep más 10% de FBS y 2,5 μg/mL de colorante verde fluorescente. Incubar durante 1 h a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares. A continuación, compruebe la intensidad de la fluorescencia en el microscopio, aspire el medio, lave una vez con 1X PBS y añada tripsina al 0,25% durante un máximo de 10 minutos. Neutralizar la tripsina con medio suplementado con DMEM.
3. Centrifugar a 250 x g durante 4 min para formar un pellet de celda. Aspire el medio DMEM y vuelva a suspender en HBSS para lavar el exceso de tinte fluorescente. Cuente las células con un hemocitómetro.
4. Lleve los óvulos a la cabina de flujo laminar de cultivo celular. Con unas tijeras y unas pinzas, abra el apósito de película transparente que cubre el huevo (Figura 1E-F).
5. Vuelva a centrifugar el número calculado de células, aspire el medio HBSS y vuelva a suspender a una concentración final de 0,5 a 1 x 10⁶ células por 5 μL del mismo medio (Figura 1G). Preparar la cantidad necesaria para el número total de huevos (5 μL de suspensión celular por huevo).
6. Coloque 5 μL de solución celular en el CAM, a unos 2 mm del DRG (Figura 1H). Mantenga distancias uniformes entre el DRG y las celdas. Tenga mucho cuidado de no alterar el huevo para minimizar la propagación de las células.
   nota: Para iniciar la implantación celular, elija óvulos en los que la superficie CAM esté visualmente seca. Si la superficie está demasiado húmeda, las células pueden diseminarse y no formar tumores regulares.
7. Cubra el huevo con un nuevo apósito de película como en el paso 1.4. Injerta las células en todos los óvulos. Incubar los huevos en una incubadora humidificadora a 38 °C y 54% de humedad durante 7 días, sin rotación.

Resultados

Figura 1: Injerto de DRG, células y recolección de CAM: En el día 8: A. La CAM se observa fácilmente después de la eliminación de la membrana de cera de parafina. B-C. Con pinzas finas, se coloca DRG en el CAM. D. El huevo se cubre con un apósito de película y se coloca en la incubadora; Las flechas señalan las aberturas que están cubiert...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora de huevos	GQF Deportista Digital	#1502	Incubadora de huevos equipada con rotador automático, termostato digital, controles de temperatura y humedad
Cortador de grabado	DREMEL	#108	Se utiliza para perforar la cáscara del huevo
Pinza Graefe extrafina, curvada	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	#11151-10	Se utiliza para injertar DRG en la CAM el día 8 y para recolectar tejido CAM el día 17
Pinzas Graefe extrafinas, rectas	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	#11150-10	Se utiliza para injertar DRG en el CAM el día 8 y para recolectar tejido CAM el día 17
Huevos fecundados de Lohmann White Leghorn			Óvulos fertilizados en los primeros días de fertilización, preferiblemente en el primer día después de la fertilización. Los huevos utilizados en este protocolo provienen de la granja avícola de la Universidad Estatal de Michigan.
Pinzas de filtro	EMD Millipore	#XX6200006P	Pinzas romas utilizadas para extraer la cáscara del huevo
HBSS (1x)	Gibco	#14025-092	La solución salina equilibrada de Hank
Membrana de cera de parafina	Película de laboratorio Parafilm	#PM-996	Se utiliza para cubrir temporalmente las aberturas de los óvulos hasta el injerto de DRG el día 8
PBS (1x) pH 7.4	Gibco	#10010-023	Solución salina tamponada con fosfato
Tegaderm Apósito de Película Transparente	3M	#9505W	Estéril, 6x7cm utilizado para cubrir las aberturas de los huevos durante la incubación