Modelado del tratamiento intratumoral con inhibidores de miARN: un método para analizar el efecto de los inhibidores de miARN en el crecimiento tumoral en un modelo murino

Resumen

Fuente: Ramírez-Moya, J. et al. Inhibición in vivo de microARN para disminuir el crecimiento tumoral en ratones. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la administración in vivo de inhibidores de miRNA como agentes terapéuticos contra el crecimiento tumoral en modelos de ratón ortotópicos. La administración intratumoral de inhibidores sintéticos de miRNAs o antagomiRs les permite unirse e inhibir miRNAs endógenos, causando así una regulación positiva del ARNm y la supresión del crecimiento tumoral.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Inoculación de células en el flanco y tratamiento de antagomiR intratumoral

1. Preparación de células
   1. Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humano Cal62 (mutaciones KRASG12R y p53A161D) para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Seleccionar las células transgénicas por resistencia a los antibióticos o clasificando las células GFP positivas con citometría de flujo.
   2. Cultive las células en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina, estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C y 5% de CO₂.
   3. Suspender 1 x 10⁶ células en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C.
2. Inoculación celular en los flancos de ratones
   1. Mezclar las células con la misma cantidad de matriz de membrana basal. Por ejemplo, agregue 1 x 10⁶ celdas en 50 μL de PBS a 50 μL de matriz de membrana basal (consulte la Tabla de materiales) y mezcle suavemente.
   2. Inyecte 100 μL de la muestra (células en PBS + matriz de membrana basal) por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones nu/nu con inmunodeficiencia BALB/c de 6 semanas de edad utilizando una jeringa de insulina de 1 mL con una aguja de 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
3. Tratamiento del antagomiR intratumoral
   1. Suspender el antagomiR (ver Tabla de Materiales) o el control negativo en 500 μL de agua destilada libre de RNasa.
   2. Antes de la inyección, prepare 2 nmol del antagomiR o del testigo junto con un reactivo de administración in vivo (véase la tabla de materiales) para cada inyección.
      1. En primer lugar, mezcle la solución de antagomiR (ver Tabla de Materiales) y el tampón de complejación (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Por ejemplo, agregue 80 μL de solución de inhibidor de miRNA (16 nmol) a 80 μL de tampón de complejación (incluido en el kit de reactivos de administración in vivo, consulte la Tabla de materiales).
      2. Lleve el reactivo de administración in vivo a temperatura ambiente. Añadir 160 μL a un tubo de 1,5 mL e inmediatamente añadir 160 μL de solución diluida de antagomiR. Vuelva a colocar el reactivo restante a -20 °C. Si es necesario, almacene el reactivo a 4 °C hasta una semana después de la descongelación.
      3. Vórtice inmediatamente (10 s) para asegurar la complejación del reactivo de administración in vivo-antagomiR.
      4. Incubar la mezcla de reactivo de administración in vivo-antagomiR durante 30 min a 50 °C. Centrifugar el tubo brevemente para recuperar la muestra.
      5. Diluya el complejo 6 veces agregando 1360 μL de PBS pH 7.4 y mezcle bien.
      6. Proceda con la administración in vivo del complejo reactivo-antagomiR (8 ratones/condición) o almacene el complejo a 4 °C durante un máximo de una semana antes de la inyección. Inyectar 200 μL intratumoral en cada tumor (2 nmol de antagomiR).
         NOTA: El volumen y la cantidad de antagomiR son independientes del volumen tumoral.
   3. Realice el tratamiento 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas.
4. Análisis del crecimiento tumoral
   1. Inyecte 50 μL de una solución de 40 mg/mL de sustrato de D-luciferina (ver Tabla de Materiales) por vía subcutánea en cada punto de tiempo con una jeringa de 1 mL con una aguja de 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
      1. A los 8 minutos después de la inyección, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% mezclado con oxígeno. Evalúe el nivel de anestesia mediante el reflejo del pie (pellizco firme del dedo del pie) y ajuste la administración de anestésico según corresponda para mantener el plano quirúrgico.
      2. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la desecación.
5. Visualice la señal bioluminiscente con un software de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Los calibradores también se pueden usar para medir el volumen y el crecimiento del tumor.
6. Una vez obtenidas las señales de bioluminiscencia, analizar el crecimiento tumoral comparando ambos tratamientos y determinar la significación mediante una prueba t. Para analizar la varianza dentro del grupo, utilice el SEM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz de membrana basal: Matriz de membrana basal Matrigel de alta concentración	Corning	#354248
AntagomiR: inhibidor del miRNA mirVana	Termo Fisher	4464088	Listo para in vivo
Reactivo de administración in vivo: Reactivo Invivofectamine 3.0	Termo Fisher	FIV 3005
Control negativo: Inhibidor de miRNA mirVana, control negativo #1	Termo Fisher	4464077	Listo para in vivo
XenoLight D-Luciferin - Sustrato bioluminiscente de sal K+	PerkinElmer	122799	Diluido en PBS
Software de imagen in vivo: IVISLumina II Imaging System	Ciencias de la vida de Caliper