Incrustación de esferoides 3D en gotas de gel de agarosa: una técnica para preservar los esferoides para el análisis posterior

En este artículo

Resumen

Fuente: Rolver, M. G. et al. Evaluación de la viabilidad y muerte celular en cultivos esferoidles 3D de células cancerosas. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe la técnica para incrustar esferoides 3D en gotas de gel de agarosa para su conservación. Los esferoides 3D integrados se pueden utilizar posteriormente para el análisis posterior.

Protocolo

1. Incrustación de esferoides 3D

Prepare el gel de agarosa en el que se incrustan los esferoides (solo es necesario la primera vez que realiza el protocolo)
1. Mezclar 1 g de bacto-agar en 50 mL de ddH₂O.
2. Calentar lentamente en el horno microondas hasta que el bacto-agar se haya disuelto y se haya formado un gel homogéneo. No permita que el gel hierva.
3. Mantener el bacto-agar caliente en un baño de agua a 60 °C.
4. Mantener a 4 °C entre experimentos.
Incrustación de esferoides
1. El día 1, para cada afección, reúna un mínimo de 12 esferoides en un tubo de 1,5 ml.
2. Lavar una vez con 1 mL de PBS 1X helado.
3. Para fijar los esferoides, agregue 1 mL de paraformaldehído al 4%.
  nota: La manipulación del paraformaldehído debe realizarse en una campana extractora.
4. Déjalos incubar durante 24 h en RT.
5. El día 2, caliente el gel de agarosa con cuidado colocándolo en un vaso de precipitados lleno de agua en un horno microondas. Asegúrese de que el gel no hierva. Manténgalo caliente en una placa calefactora de sobremesa, a 60 °C hasta su uso.
6. Lave los esferoides dos veces con 1 ml de PBS 1X helado.
7. Aspire la mayor parte del PBS 1X (dejar aproximadamente 100 μL en este punto es práctico para manejar los esferoides).
8. Prepare una pipeta de 20 μL cortando la punta de la pipeta inclinada para obtener una punta más puntiaguda con un orificio más grande (Figura 1).
  NOTA: La siguiente parte debe hacerse rápidamente para garantizar una transferencia óptima de esferoides y evitar la solidificación de la gota de gel. Si no se dispone de un bloque calefactor, se recomienda recoger primero los esferoides y luego hacer caer la agarosa (es decir, cambiar el orden de los puntos 1.2.9 y 1.2.10).
9. Haz una gota de gel de agarosa en un portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sobre un bloque calefactor tibio para evitar que la agarosa se solidifique.
10. Con la punta de pipeta modificada (paso 1.2.8), recoja el mayor número posible de esferoides en un volumen de 15-20 μL.
11. Inyecte con cuidado los 15-20 μL de PBS 1X que contienen esferoide en el centro de la gota de gel de agarosa sin tocar el portaobjetos del microscopio.
  nota: Este es un punto un poco difícil. Los esferoides se perderán si la punta de la pipeta toca el portaobjetos del microscopio al inyectar los esferoides en la gota de gel. Es recomendable practicar todo el proceso de hacer la gota de agarosa e inyectar los esferoides inyectando un líquido coloreado en la gota. Esto permitirá la visualización de una posible penetración a través de la gota, ya que el líquido coloreado se filtrará sobre el portaobjetos.
12. Deje que la gota de agarosa se endurezca incubando durante 5-10 min a RT o a 4 °C. Una vez que la gota de gel se haya solidificado un poco (pero aún esté bastante blanda), empuje con cuidado la gota de gel del portaobjetos del microscopio a un casete de papel de plástico con un bisturí.
13. Cubra los casetes de papel tisú de plástico con etanol al 70%.
  nota: En este punto, los esferoides se pueden usar directamente o almacenar durante meses.
14. Incrustar el esferoide incrustado en agarosa en parafina, cortarlo en portaobjetos de capa de 2-3 μm de espesor y teñirlo con hematoxilina y eosina o someterlo a tinción inmunohistológica.

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Resultados

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Figura 1: Fijación, inclusión y análisis inmunohistoquímico de esferoides. (A) Representación esquemática del protocolo de inclusión de esferoides. Los pasos individuales están marcados como (i-vii). (B) Imagen del esferoide MDA-MB-231 incrustado. Barra de escala: 50 μm. (C) Imagen representativa del esferoide MDA-MB-231 ...