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Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de la matriz extracelular de la lengua (TEM)
- Ejecutar ratones por luxación cervical y extraer las lenguas con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas.
- Sumerja las lenguas en etanol al 75% durante 3 minutos, luego coloque cada lengua en un tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL con 1 mL de solución tamponada de fosfato estéril (PBS) de 10 mM><.
nota: La concentración de PBS en todos los pasos siguientes es la misma que la concentración en este paso.
- Lisis celular por congelación-descongelación: Congelar las lenguas en tubos electroelectromagnéticos a -80 °C durante 1 h y luego descongelar las lenguas a temperatura ambiente durante 45 min durante 3 ciclos.
- Cargue cada lengua en un trozo de sutura quirúrgica con una aguja quirúrgica y envuelva el extremo de la sutura con un pequeño trozo de papel de aluminio estéril. Realizar la operación en una placa de cultivo de 3,5 cm o 6 cm que contenga etanol al 75% en condiciones estériles.
nota: La longitud adecuada de cada pieza de sutura quirúrgica es de unos 20 cm, y el tamaño adecuado de cada pieza de papel de aluminio es de aproximadamente 0,3cm2 (1 cm x 0,3 cm). La lengua debe cargarse cerca del papel de aluminio.
- Enjuague cada lengua con 3 mL de PBS estéril en una placa de cultivo de 3,5 cm o 6 cm durante 30 s. Realice esta operación en condiciones estériles.
- Lavar las lenguas con agua ultrapura: Añadir ampicilina en un frasco de boca ancha con 250 mL de agua ultrapura estéril hasta una concentración final de 90 μg/mL. Coloque las lenguas en la botella que contiene una barra para revolver. Apriete la tapa del frasco con parte de la sutura que quede fuera del frasco. Realice esta operación en condiciones estériles.
nota: Se pueden poner hasta 5 lenguas en el mismo frasco teniendo en cuenta el enroscado de la sutura. El papel de aluminio se encuentra en el extremo de la sutura en el frasco para evitar que la lengua se deslice. Las lengüetas deben colocarse a 2 cm de altura desde el fondo del frasco ajustando la longitud de la sutura que queda dentro del frasco. Esta nota también es para los pasos 1.8, 1.10, 1.12 y 1.16.
- Coloque la botella en un agitador magnético durante 12 h.
- Lavar las lenguas con NaCl: Añadir ampicilina en un frasco de boca ancha con 250 mL de NaCl estéril 1 M hasta una concentración final de 90 μg/mL. Mueva las lenguas y la barra para remover dentro de la botella. Apriete la tapa del frasco con parte de la sutura que quede fuera del frasco. Realice esta operación en condiciones estériles.
- Coloque la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Lisis celular por Triton X-100: Agregue ampicilina a una concentración final de 90 μg/mL en un frasco de boca ancha con 250 mL de Triton X-100 estéril al 2% en PBS. Mueva las lenguas y la barra para remover dentro de la botella. Apriete la tapa del frasco con parte de la sutura que quede fuera del frasco. Realice esta operación en condiciones estériles.
- Coloque la botella en un agitador magnético durante 48 h.
- Lavar la lengua con CaCl2/MgCl2: Añadir ampicilina en un frasco de boca ancha con 250 mL de CaCl2/MgCl2 estéril de 5 mM hasta una concentración final de 90 μg/mL. Mueva las lenguas y la barra para remover dentro de la botella. Apriete la tapa del frasco con parte de la sutura que quede fuera del frasco. Realice esta operación en condiciones estériles.
- Coloque la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Digestión por DNasa: Agregue 1 mL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada tubo EP. Añadir DNasa en HBSS respectivamente hasta una concentración final de 300 μM. Mover cada lengua dentro de cada tubo EP, con parte de la sutura fuera del tubo. Realice esta operación en condiciones estériles.
nota: Asegúrese de que la parte de la sutura que permanece dentro de los frascos en los pasos anteriores también permanezca dentro del tubo EP en este paso, y asegúrese de que la parte de la sutura que permanece fuera de los frascos en los pasos anteriores también permanezca fuera del tubo EP en este paso.
- Incubar las lenguas en tubos electromagnéticos a 37 °C durante 24 h.
- Lavar las lenguas con PBS: Añadir ampicilina en un frasco de boca ancha con 250 mL de PBS estéril hasta una concentración final de 90 μg/mL. Mueva las lenguas y la barra para remover dentro de la botella. Apriete la tapa del frasco con parte de la sutura que quede fuera del frasco. Realice esta operación en condiciones estériles.
- Coloque la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Guarde el TEM preparado en PBS estéril a 4 °C hasta su uso.