Criomolienda de tejido descelularizado: una técnica para obtener polvo fino de matriz extracelular

Resumen

Fuente: Kornmuller, A. et al. Fabricación de espumas y microportadores derivados de matrices extracelulares como plataformas de cultivo y administración celular específicas de tejidos. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, presentamos el protocolo para obtener polvo de matriz extracelular finamente molido a partir de tejido descelularizado liofilizado por criomolienda. El ECM en polvo conserva su composición bioquímica y puede utilizarse para la síntesis de microportadores.

Protocolo

1. Procesamiento de tejidos descelularizados

1. Descelularización y liofilización
   1. Descelularizar el/los tejido(s) de interés siguiendo un protocolo establecido.
      nota: Los andamios del presente estudio se han preparado siguiendo los protocolos de descelularización publicados para el DAT humano, el DDT porcino y el DLV porcino. El colágeno insoluble disponible en el mercado también se puede utilizar para fabricar espumas y microportadores, como el colágeno procedente del tendón bovino, que se ha utilizado con éxito en un rango de concentración de 10 a 50 mg/mL. Se pueden utilizar otras fuentes de colágeno insolubles, pero pueden requerir optimización para identificar el rango de concentración que producirá andamios estables.
   2. Transfiera el tejido descelularizado hidratado o el colágeno purificado a un tubo de centrífuga de 50 mL con pinzas y agregue suficiente agua destilada doble (ddH₂O) para sumergir el tejido, hasta un volumen total máximo de 35 mL.
   3. Congele la muestra durante la noche a -80 °C, con el tubo de centrífuga colocado horizontalmente durante la congelación para maximizar el área de superficie para la sublimación durante la liofilización posterior.
   4. Retire la tapa del tubo de centrífuga y transfiera la muestra congelada a un frasco de liofilización.
   5. Liofilizar la muestra con un liofilizador de laboratorio durante 48-72 h o hasta que esté completamente seca.
      nota: El tiempo de secado puede variar para diferentes liofilizadores y tejidos descelularizados.
   6. Picar finamente la MEC liofilizada en trozos pequeños (~ 1-2 mm³) con unas tijeras quirúrgicas afiladas.
   7. Guarde el ECM picado en un desecador hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
      nota: Se recomienda que el ECM picado se use inmediatamente para evitar la absorción de humedad del medio ambiente.
2. Criomolienda (opcional para la fabricación de espuma)
   1. Llene una cámara de fresado de acero inoxidable de 25 mL para un sistema de molino de bolas de laboratorio con ECM liofilizado picado y agregue dos bolas de fresado de acero inoxidable de 10 mm.
   2. Cierre y sumerja completamente la cámara de molienda cargada en nitrógeno líquido durante 3 min.
   3. Moler la muestra congelada durante 3 minutos a 30 Hz (1.800 rpm).
   4. Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3 hasta que el ECM se muela hasta obtener un polvo fino.
      nota: El número de veces que se deben repetir estos pasos puede variar entre las fuentes de ECM. Por ejemplo, DAT normalmente requiere 3 ciclos de molienda para generar un polvo fino.
   5. Transfiera el polvo con una cucharada a un frasco de vidrio, selle herméticamente y guárdelo en un desecador.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cables de pinza de cocodrilo	VWR	470149-728
Papel de aluminio	Fisher Científico	01-213-101
Balanza analítica	sartorio	CPA225D
Sistema de criomolienda	Retsch	20.745.0001	400 milímetros
Desecador	Fisher Científico	8624426	Para el almacenamiento de ECM liofilizado y bioandamios
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baja; rango de volumen de 250 - 500 mL
Agua bidestilada (ddH2O)			Del sistema de purificación de agua GenPure xCAD de Barnstead
ECM (Matriz Extracelular)			Aislado de tejido adiposo humano, dermis porcina o miocardio porcino, como se describe en Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 y Wainwright et al. 2010
fórceps	VWR	37-501-32	Para la transferencia de las espumas
Congelador (-20 °C)	VWR	97043-346
Congelador ( -80 °C)	Termo Científico	EXF40086A
Viales de vidrio	Fisher Científico	03-339-26D	Para almacenar ECM criomilada liofilizada
nitrógeno líquido			Para electropulverización
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Libre4.5
Cámara de molienda	Retsch	02.462.0213	Volumen recomendado de 25 mL
Bolas de molienda	VWR	Números 16003-606	10 mm de diámetro, se recomienda acero inoxidable
Penicilina-estreptomicina	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122	Se utiliza para los medios de proliferación
Pipet-Aid XP	Mandel Científico	DRU-4-000-101
Scoopula	VWR	89259-968	Para la recogida de microportadores
Tijeras quirúrgicas	VWR	82027-590