Preparación de suspensiones de ECM: una técnica para obtener una suspensión homogénea a partir de una matriz extracelular derivada de tejidos

Resumen

Fuente: Kornmuller, A. et al. Fabricación de espumas y microportadores derivados de matrices extracelulares como plataformas de cultivo y administración celular específicas de tejidos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe la preparación de una suspensión de matriz extracelular homogeneizada y digerida a partir de tejidos descelularizados y liofilizados. Esta técnica ayuda a fabricar espumas porosas y microportadores derivados de ECM para su uso como sustratos en modelos avanzados de cultivo celular en 3D.

Protocolo

1. Procesamiento de tejidos descelularizados

1. Descelularización y liofilización
   1. Descelularizar el/los tejido(s) de interés siguiendo un protocolo establecido.
      nota: Los andamios del presente estudio se han preparado siguiendo los protocolos de descelularización publicados para el tejido adiposo descelularizado (DAT) humano, el tejido dérmico descelularizado porcino (DDT) y el ventrículo izquierdo descelularizado porcino (DLV). El colágeno insoluble disponible en el mercado también se puede utilizar para fabricar espumas y microportadores, como el colágeno procedente del tendón bovino, que se ha utilizado con éxito en un rango de concentración de 10 a 50 mg/mL. Se pueden utilizar otras fuentes de colágeno insolubles, pero pueden requerir optimización para identificar el rango de concentración que producirá andamios estables.
   2. Transfiera el tejido descelularizado hidratado o el colágeno purificado a un tubo de centrífuga de 50 mL con pinzas y agregue suficiente agua destilada doble (ddH₂O) para sumergir el tejido, hasta un volumen total máximo de 35 mL.
   3. Congele la muestra durante la noche a -80 °C, con el tubo de centrífuga colocado horizontalmente durante la congelación para maximizar el área de superficie para la sublimación durante la liofilización posterior.
   4. Retire la tapa del tubo de centrífuga y transfiera la muestra congelada a un frasco de liofilización.
   5. Liofilizar la muestra con un liofilizador de laboratorio durante 48-72 h o hasta que esté completamente seca.
      nota: El tiempo de secado puede variar para diferentes liofilizadores y tejidos descelularizados.
   6. Picar finamente la MEC liofilizada en trozos pequeños (~1-2 mm³) con unas tijeras quirúrgicas afiladas.
   7. Guarde el ECM picado en un desecador hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
      nota: Se recomienda que el ECM picado se use inmediatamente para evitar la absorción de humedad del medio ambiente.
2. Criomolienda
   1. Llene una cámara de fresado de acero inoxidable de 25 mL para un sistema de molino de bolas de laboratorio con ECM liofilizado picado y agregue dos bolas de fresado de acero inoxidable de 10 mm.
   2. Cierre y sumerja completamente la cámara de molienda cargada en nitrógeno líquido durante 3 min.
   3. Moler la muestra congelada durante 3 min a 30 Hz (1.800 rpm) hasta convertirla en un polvo fino.
      nota: El número de veces que se deben repetir estos pasos puede variar entre las fuentes de ECM. Por ejemplo, DAT normalmente requiere 3 ciclos de molienda para generar un polvo fino.
3. Preparación de la suspensión ECM
   1. Pesa 250 mg de ECM picada (para espumas) o criomolada (para espumas o microportadores) y transfiérela a un tubo de centrífuga de 15 mL. Consulte el paso 1.1.6 y la sección 1.2 para la preparación de la MEC picada y la MEC criomolada, respectivamente.
      nota: Este protocolo está diseñado para preparar una suspensión de ECM de 50 mg/mL, que se recomienda para el DAT humano, el DDT porcino y el DLV porcino. Dependiendo de la fuente específica de ECM, se pueden generar suspensiones uniformes a concentraciones de arranque más altas o más bajas.
   2. Añada 5 mL de tampón 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) al tubo de centrífuga y marque el nivel de líquido en el tubo.
   3. Prepare una solución madre de α-amilasa añadiendo 7,5 mg de α-amilasa a 1 ml de tampón 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4). Añadir 100 μL de la solución madre de α-amilasa (0,75 mg de α-amilasa: 0,3% p/p de tejido seco) a la muestra. Añadir 0,22 M NaH₂PO₄ para obtener un volumen final de 10 mL.
   4. Agite la suspensión continuamente a 300 rpm durante 72 h a temperatura ambiente.
   5. Centrifugar la suspensión a 1.500 x g durante 10 min. Recoja y deséchese cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de ECM digerido. Resuspender el material peletizado en 10 mL de NaCl al 5% diluido en ddH₂O.
   6. Repita el paso 1.3.5 para un total de dos enjuagues con NaCl al 5% en ddH₂O.
   7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el material peletizado en 10 mL de ddH₂O.
   8. Agite la suspensión continuamente a 300 rpm durante 10 min en RT.
   9. Centrifugar la suspensión a 1.500 x g durante 10 min. Recoja y deséchese cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de ECM digerido.
   10. Añadir ácido acético 0,2 M a la marca de 5 mL hecha en el paso 1.3.2.
   11. Agite la suspensión continuamente a 120 rpm O/N a 37 °C.
   12. Homogeneizar la suspensión ECM a temperatura ambiente en intervalos de 10 segundos utilizando un homogeneizador manual equipado con una sonda de diente de sierra de 10 mm de ancho hasta que no queden fragmentos visibles. Coloque la suspensión en un vaso de precipitados con agua fría entre los intervalos de homogeneización para evitar el sobrecalentamiento.
       nota: Dependiendo de la fuente de ECM, puede ser necesaria una dilución adicional en ácido acético 0,2 M para obtener una suspensión homogénea. El enfriamiento excesivo de la suspensión ECM puede resultar en un aumento de la viscosidad que puede interferir con la homogeneización eficiente. Si se observa un aumento en la viscosidad, la muestra se puede recalentar a 37 °C y someter a un procesamiento adicional.
   13. Almacene a 4 °C hasta un mes antes de la fabricación de espuma o microportadores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido acético glacial	BioShop (Tienda Biológica)	ACE222.5
α-amilasa	sigma	101074694	de Aspergillus aryzae
Centrífuga 75004251	Termo Científico		Con rotor de cangilón oscilante para tubos de centrífuga de 15 y 50 mL
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Desecador	Fisher Científico	8624426	Para el almacenamiento de ECM liofilizado y bioandamios
Agua bidestilada (ddH2O)			Del sistema de purificación de agua GenPure xCAD de Barnstead
ECM (Matriz Extracelular)			Aislado de tejido adiposo humano, dermis porcina o miocardio porcino, como se describe en Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 y Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Homogeneizador de mano	Fisher Científico	14-359-251	Velocidad: 8.000 - 30.000 rpm
Accesorios para homogeneizadores: sondas generadoras de fondo de diente de sierra	Fisher Científico	14-261-17	10 x 95 mm
nitrógeno líquido
cloruro de sodio	BioShop (Tienda Biológica)	7647-14-5
Fosfato de sodio monobásico	BioShop (Tienda Biológica)	10049-21-5
Tijeras quirúrgicas	VWR	82027-590