Fabricación de espuma derivada de matriz extracelular mediante liofilización: un procedimiento para generar andamios biológicos a partir de ECM de tejidos descelularizados

Resumen

Fuente: Kornmuller, A. et al. Fabricación de espumas y microportadores derivados de matrices extracelulares como plataformas de cultivo y administración celular específicas de tejidos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe el método para sintetizar espumas puras derivadas de ECM sin la necesidad de reticulación química. Estas espumas derivadas de ECM encuentran aplicaciones como modelos avanzados de cultivo celular in vitro en 3D o como bioandamios pro-regenerativos.

Protocolo

1. Fabricación de espuma derivada de ECM

1. Prepare la suspensión homogénea de ECM dispersando el polvo fino de ECM en una solución tampón e incube a 37 °C con agitación continua a 120 rpm hasta que la suspensión esté caliente.
2. Diluir la suspensión de ECM en ácido acético 0,2 M hasta la concentración deseada.
   nota: Dependiendo de la fuente de ECM, se pueden preparar espumas estables en el rango de 10 a 100 mg/mL, con 15 a 50 mg/mL como el rango recomendado para DAT, DDT y DLV. Por lo general, las espumas fabricadas en concentraciones más altas serán un poco menos porosas pero más estables en el cultivo y más fáciles de manipular.
3. Usando una jeringa de 3 mL con una aguja de 18G para evitar la formación de burbujas en la suspensión de ECM, llene el molde deseado con la suspensión de ECM. Para fabricar las espumas DAT, DDT y DLV, dispense 400 μL de suspensión de ECM de 35 mg/mL en una placa tratada con cultivo celular de 48 pocillos.
   nota: La forma del molde seleccionado y el volumen de la suspensión ECM determinarán la geometría de la espuma resultante.
4. Cubra y congele los moldes durante la noche colocándolos en un congelador de -20 °C o -80 °C.
   nota: La temperatura de congelación puede afectar la porosidad de las espumas. Se esperan poros más grandes cuando las muestras se congelan a -20 °C en comparación con -80 °C debido a la formación de cristales de hielo más grandes. Para fabricar espumas con una estructura porosa uniforme, asegúrese de que el molde no esté en contacto con una superficie conductora para evitar el enfriamiento direccional.
5. Coloque los moldes que contienen las muestras congeladas en un matraz liofilizador. Conecte el matraz liofilizador al sistema de liofilizador de laboratorio y séquelo durante 24 h.
   NOTA: Es importante que la muestra permanezca congelada antes de la liofilización.
6. Guarde las espumas liofilizadas en un desecador hasta que las necesite.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Balanza analítica	sartorio	CPA225D
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Colágeno del tendón de Aquiles bovino Tendón (insoluble)	sigma	C9879	O colágeno insoluble similar fuente; Se puede utilizar como un Alternativa a la descelularizada tejidos para fabricar las espumas y Microportadores
Desecador	Fisher Científico	8624426	Para ECM liofilizado y Almacenamiento de bioandamios
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baja; rango de volumen de 250 -500 mL
Agua bidestilada (ddH_{2} O)			De Barnstead GenPure xCAD Sistema de purificación de agua
D-PBS (tamponado con fosfato Solución salina)	bisonte europeo	311425125
ECM (Matriz Extracelular)			Aislado del tejido adiposo humano tejido, dermis porcina o porcina miocardio, como se describe en Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 y Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, Artículo 32)
fórceps	VWR	37-501-32	Para la transferencia de las espumas
Congelador (-20 °C)	VWR	97043-346
Congelador ( -80 °C)	Termo Científico	EXF40086A
Viales de vidrio	Fisher Científico	03-339-26D	Para almacenar criomolado liofilizado Ecm
nitrógeno líquido			Para electropulverización
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Libre4.5
Aguja de 18 G	VWR	C ABD305185	Para la dispensación de ECM suspensión en moldes
Agitador de incubadora orbital	SciLogex	832010089999	Temperatura controlada (37 °C)
Pipetas serológicas (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001
Pipetas serológicas (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
cloruro de sodio	BioShop (Tienda Biológica)	7647-14-5
Fosfato de sodio monobásico	BioShop (Tienda Biológica)	10049-21-5