Fabricación de bioandamios por electropulverización: una técnica para generar andamios de microportadores derivados de la matriz extracelular de tejido descelularizado

Resumen

Fuente: Kornmuller, A. et al. Fabricación de espumas y microportadores derivados de matrices extracelulares como plataformas de cultivo y administración celular específicas de tejidos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra el procedimiento de fabricación de microportadores derivados de matriz extracelular por electroaspersión. Estos microportadores simulan el microambiente específico del tejido nativo y son estables en modelos de cultivo celular in vitro en 3D a largo plazo.

Protocolo

1. Fabricación de microportadores derivados de ECM mediante electropulverización

NOTA: En la Figura 1 se muestra un resumen de la configuración de la electropulverización.

1. Incubar una suspensión de ECM criomolada previamente preparada a 37 °C con agitación continua a 100 rpm O/N.
   nota: El ECM criomolado se utiliza para fabricar los microportadores derivados del ECM para garantizar una mayor uniformidad en la suspensión y evitar la obstrucción durante la electropulverización.
2. Cargue 3 mL de suspensión ECM en una jeringa Luer-Lock de 3 mL y coloque un juego de infusión alado en el orificio de la jeringa.
   nota: Se puede utilizar una gama de calibres de aguja, reconociendo que la selección puede influir en el tamaño y la forma de los microportadores resultantes. Para fabricar los microportadores DAT, DDT y DLV, utilice una aguja de 25G.
3. Asegure la jeringa dentro de la bomba de jeringa. Fije la aguja a un soporte de retorta y coloque la punta de la aguja verticalmente a una distancia de 4 a 6 cm de la parte superior de un matraz Dewar de forma baja (se recomienda un rango de tamaño de 250 a 500 ml).
4. Conecte un electrodo de pinza de cocodrilo a la punta de la aguja y conéctelo al terminal positivo de la fuente de alimentación de alto voltaje.
5. Doble una tira de papel de aluminio (12 x 5 cm) sobre el borde del matraz de vacío.
6. Conecte un segundo electrodo de pinza de cocodrilo al borde exterior de la lámina y conéctelo al terminal de la fuente de tierra de la fuente de alimentación.
7. Llene el matraz Dewar con nitrógeno líquido hasta aproximadamente 1 cm de la parte superior para que 3/4 del papel de aluminio quede sumergido.
   nota: Es importante mantener el matraz Dewar lleno de nitrógeno líquido. La superficie del nitrógeno líquido no debe estar a menos de 2 cm de la parte superior del matraz durante el proceso de electropulverización. Se requiere un rellenado continuo del nitrógeno líquido para mantener un nivel constante durante la electropulverización.
8. Ajuste la bomba de jeringa a una velocidad de infusión de 30 mL/h.
   nota: Variar la velocidad de infusión puede alterar la forma y el diámetro del microportador, pero el rango recomendado es de 25-35 mL/h. Si bien depende en gran medida de la viscosidad de la suspensión, los caudales inferiores a 25 mL/h pueden dar lugar a la generación de microportadores más grandes. A caudales muy bajos, el tamaño y la forma de los microportadores pueden volverse menos homogéneos. A velocidades de infusión superiores a 35 mL/h, la uniformidad de las gotas generadas mediante electropulverización puede verse alterada, lo que da lugar a microportadores no esféricos con una distribución de tamaño más amplia.
9. Aplique un voltaje de 20 kV y encienda la bomba de jeringa para iniciar la electropulverización.
   nota: El voltaje puede variar para ajustar el tamaño de los microportadores y tiende a tener un mayor impacto en el diámetro que la velocidad de infusión. El rango de voltaje recomendado es de 15 a 25 kV. Se espera una disminución en el diámetro del microportador con un aumento en el voltaje.
10. Una vez completada la infusión, vierta con cuidado el exceso de nitrógeno líquido del Dewar, dejando los microportadores suspendidos en ~ 25 mL de nitrógeno líquido para garantizar que permanezcan congelados.
11. Transfiera inmediatamente los microportadores con el nitrógeno líquido a un tubo de centrífuga de 50 ml vertiendo con un movimiento suave. Recoja los microportadores congelados que queden en el Dewar con una cuchara y agréguelos al tubo de centrífuga.
    nota: Dependiendo del tamaño del Dewar, los microportadores en nitrógeno líquido se pueden verter inicialmente en un recipiente de tamaño mediano y luego transferirse inmediatamente al tubo de centrífuga de 50 mL.
12. Cubra el tubo de centrífuga que contiene los microportadores en nitrógeno líquido con papel de aluminio perforado con pequeños orificios en preparación para la liofilización.
13. Coloque los tubos de centrífuga cubiertos en un matraz liofilizador. Conecte inmediatamente el matraz al liofilizador y seque las muestras O/N.
    nota: Es muy importante mantener los microportadores suspendidos en nitrógeno líquido para asegurarse de que no se descongelen antes de este paso, ya que la descongelación puede provocar el colapso y/o la agregación. Los microportadores de DAT, DDT y DLV fabricados a una concentración de 35 mg/mL utilizando las condiciones de electropulverización descritas anteriormente suelen tener un diámetro hidratado que oscila entre 350 y 500 μm. La distribución del tamaño puede variar en función de la fuente del ECM.
14. Guarde los microportadores liofilizados en un desecador hasta que los necesite.

Resultados

Figura 1. Descripción general del aparato de electropulverización utilizado en la fabricación de microportadores. A: Imagen que muestra la disposición del equipo clave de electropulverización, incluida la bomba de jeringa y la fuente de alimentación de alto voltaje, así como el posicionamiento de la aguja en relación con el Dewar de nitrógeno líquido. B: Esquema de electr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cables de pinza de cocodrilo	VWR	470149-728
Papel de aluminio	Fisher Científico	01-213-101
Tubos de centrífuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Desecador	Fisher Científico	8624426	Para el almacenamiento de ECM liofilizado y bioandamios
Frasco Dewar	Fisher Científico	10-196-6	Forma baja; rango de volumen de 250 - 500 mL
ECM (Matriz Extracelular)			Aislado de tejido adiposo humano, dermis porcina o miocardio porcino, como se describe en Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 y Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
nitrógeno líquido			Para electropulverización
Liofilizador	Labconco	7750021	Zona Libre4.5
Agitador de incubadora orbital	SciLogex	8.3201E+11	Temperatura controlada (37 °C)
Soporte de retorta	VWR	470019-526
Abrazadera de soporte de retorta	VWR	21573-606
Jeringa Safety-Lok	Bd	309606	Jeringa Luer lock de 3 mL para la fabricación y dispensación de microportadores en suspensión de ECM
Scoopula	VWR	89259-968	Para la recogida de microportadores
Bomba de jeringa	VWR	10117-490	Controlado por microprocesador
Fuente de alimentación de alto voltaje	Investigación Gamma de Alto Voltaje	ES30P-5W/DDPM	Capaz de un rango de voltaje recomendado de 15 a 25 kV
Set de infusión alado	Terumo	22258092	Longitud de tubo de 30 cm, se recomiendan 25 G 3/4"; Se pueden utilizar otros calibres de aguja que pueden influir en el diámetro del microportador